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江苏某地区既往有偿献血人群HCV感染状况及相关因素研究
目的 探索江苏某地区既往有偿献血人群HCV感染的流行状况,分析与HCV感染转归及HCV RNA载量相关的因素.方法 对该地区50岁以上人群开展横断面研究,采用问卷方式收集研究对象信息,并对其进行肝脏B超检查及相关指标检查.应用EpiData和Stata软件对数据进行录入及统计学分析.结果 该地区1 601名50岁以上人群中HCV感染率为22.55％,516名既往有偿献血人群HCV感染率为61.05％.多元逐步回归显示,ALT及AST与HCV感染转归之间存在相关性,OR值分别为1.38(95％CI:1.18 ～ 1.62)及1.30(95％CI:1.10 ～ 1.54).FPG与HCVRNA病毒载量之间存在相关性(OR=l.17,95％CI:1.01～1.35).结论 该地区HCV感染率较高,临床上ALT、AST以及FPG的检测结果与HCV的感染转归风险及病毒活动能力之间存在关联.
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反转录病毒MSCV介导汉坦病毒核蛋白基因在NIH3T3细胞中整合和表达
汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体.由S基因编码的核蛋白(NP)主要与机体的细胞免疫有关,并调节病毒的复制及诱导细胞程序性死亡.构建了汉坦病毒Z10株核蛋白cDNA与含有pac基因的反转录病毒鼠干细胞病毒(MSCV)重组体MSCV-FlagNP,通过磷酸钙转录法导入产病毒的包装细胞系BOSC23中,产生完整的重组MSCV-FlagNP病毒.然后以重组病毒感染NIH 3T3细胞,利用Puromycin的选择特性(pac基因)对感染细胞进行连续压力筛选,获得了转核蛋白抗性细胞.利用Southern blot和PCR方法分别对核蛋白基因在抗性细胞染色体整合情况及其完整性进行了鉴定.并且用Western blot在抗性细胞中可检测到核蛋白的表达.进一步以Flag单克隆抗体介导的免疫荧光染色联合共聚焦激光扫描荧光显微镜,分析了内源性Flag融合核蛋白在抗性细胞内分布,发现核蛋白主要分布于胞浆及胞核周围区,并且部分核蛋白可聚集形成胞浆包涵体.转核蛋白基因细胞模型的建立,对进一步研究汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制机制有重要意义.
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TRIM22稳定过表达细胞系的构建及其抗流感病毒的功能
目的 构建稳定表达TRIM22的HEK293T细胞系HEK293T-TRIM22,观察TRIM22蛋白在该细胞内的表达及对流感病毒复制的影响并初步探究其抑制机制.方法 扩增TRIM22基因并与反转录病毒载体进行体外重组连接,经菌液PCR、测序确认后与反转录病毒骨架载体共转染进HEK293T细胞进行包装病毒.用包装的反转录病毒感染HEK293T细胞,感染24 h后用嘌呤霉素筛选稳定过表达TRIM22的细胞,筛选48 h后用Western blot检测TRIM22表达水平;用IAV-LUC病毒检测稳定过表达TRIM22的HEK293T对流感病毒的抑制作用;再用双分子荧光互补实验(BiLC)检测与TRIM22相互作用的流感蛋白.结果 经测序确认目的基因TRIM22成功克隆到载体pQC-XIP中.包装反转录病毒并感染HEK293T细胞,经过嘌呤霉素筛选后,稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞中TRIM22的蛋白表达水平升高(P＜0.05).在稳定过表达TRIM22的细胞内流感病毒复制减弱(P＜0.05).BiLC检测TRIM22与流感蛋白NP有相互作用.结论 稳定过表达TRIM22的HEK293T细胞系构建成功,TRIM22与NP有相互作用并且抑制流感病毒复制.
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反转录病毒载体介导的P27kip1促HepG2细胞凋亡
目的 研究反转录病毒介导的P27kip1基因过表达对HepG2细胞的影响.方法 构建携带有人P27kip1基因的反转录病毒载体,经脂质体介导转染PA317包装细胞,C-418筛选获得稳定产毒细胞系,病毒感染HepG2细胞,筛选出P27kip1阳性克隆,Western blot检测P27kip1在HepG2中的表达,并通过细胞形态学观察、MTT、FCW等方法,检测P27kip1对HepG2细胞的影响.结果 成功构建了含有人P27kip1基因的pLNCX-P27反转录病毒载体并导入包装细胞获得了稳定产毒细胞系,病毒感染HepG2后P27kip1基因可在细胞内高表达,过表达P27kip1基因的细胞生长速度受阻,较多细胞阻滞于G1期,且凋亡增多.结论 构建的pLNCX-P27载体能稳定高效地将P27kip1基因导入HepG2细胞,过表达P27kip1可抑制细胞生长,加速凋亡.
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应用逆转录病毒pLXSN-EGFP示踪观察电针任脉对MCAO大鼠SVZ区NSC增殖的影响
目的:利用侧脑室注射pLXSN-EGFP在体示踪观察电针任脉对缺血侧SVZ区NSC增殖的情况,探讨电针任脉治疗缺血性脑损伤的作用机制.方法:将病毒上清注入MCAO大鼠侧脑室以标记新增殖细胞,并用Nestin免疫荧光染色法鉴定NSC,并计数不同时相缺血侧SVZ区NSC.结果:脑缺血后不同时相缺血侧SVZ区均有新增殖NSC,且电针任脉组有更明显的增加.结论:缺血可激发SVZ区NSC的增殖,电针任脉可起到明显促进作用,推论这种作用可能是是任脉的妊养和促进脑缺血后神经修复功能的重要机制.
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新型骨形态发生蛋白2反转录病毒载体的构建及活性检测
背景:骨形态发生蛋白是一种具有潜在活性的蛋白质,当骨组织损伤时其迅速增加并活性的增强,与载体复合能修复动物骨缺损,但将其用做基因治疗的研究未见报道.目的:构建表达重组人骨形态发生蛋白2基因的重组反转录病毒载体,探讨其在成骨细胞中的生物学作用.方法:根据Genbank中人骨形态发生蛋白2基因序列设计并合成骨形态发生蛋白2特异性引物,高保真PCR扩增骨形态发生蛋白2基因,同源重组法将骨形态发生蛋白2 PCR片段连接与克隆载体pDNR-CMV,构成pDNR-CMV-BMP2,经酶切、PCR和测序鉴定后,将重组质粒pDNR-CMV-BMP2和反转录病毒空质粒pLP-LNCX以loxP位点进行同源重组,构成反转录病毒载体pLP-LNCX-BMP2,转染入包装细胞PT67进行病毒包装,并用NIH3T3细胞进行病毒滴度测定;将反转录病毒感染人成骨细胞,四甲基偶氮唑盐法检测细胞生长变化,转染48 h后Western blotting检测骨形态发生蛋白2蛋白表达.结果与结论:pDNR-CMV-BMP2质粒Sall和EcoRI双酶切、PCR及测序结果均正确,重组质粒pLP-LNCX-BMP2经氯霉素及蔗糖筛选得到的阳性克隆骨形态发生蛋白2 PCR结果阳性,酶切产物与预期相一致;病毒载体pLP-LNCX-BMP2转染PT67后,G418筛选可得到稳定细胞克隆,其上清液中病毒滴度可达到5×10~8pfu;四甲基偶氮唑盐检测中反转录病毒组与正常对照组相比,72 h细胞抑制率无明显差别(P＞0.05),转染48 h后Western blotting可见骨形态发生蛋白2蛋白高表达.结果说明,实验成功克隆了骨形态发生蛋白2基因并构建其反转录病毒表达载体.
关键词： 骨形态发生蛋白2基因 反转录病毒 成骨细胞 四甲基偶氮唑盐 蛋白表达 -
大鼠RBL-2H3细胞瞬时感受器电位M7通道参与细胞存活及凋亡
背景:瞬时感受器电位M7是肥大细胞上重要的钙离子通道,但其在肥大细胞存活及凋亡过程中的作用仍未明确.目的:观察瞬时感受器电位M7通道对大鼠RBL-2H3细胞存活及凋亡的影响.方法:取对数生长期RBL-2H3细胞,①分别以50,100,200 μmol/L瞬时感受器电位通道阻断剂2-APB进行干预,并以0.1%DMSO干预的细胞及正常培养的细胞作对照.②以瞬时感受器电位M7-siRNA反转录病毒载体转染RBL-2H3细胞,并设立空载体组和正常对照组.结果与结论:经过100,200 μmol/L的2-APB作用72 h后,RBL-2H3细胞数减少,吸光度值降低(P < 0.05),细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加(P < 0.05);RBL-2H3细胞转染si-瞬时感受器电位M7 72 h 后,吸光度值降低(P < 0.05),细胞凋亡增多,早期凋亡率和总凋亡率增加(P < 0.05).说明瞬时感受器电位M7通道参与了RBL-2H3细胞存活和凋亡过程.
关键词： 瞬时感受器电位M7通道 RBL-2H3细胞 RNA干扰 反转录病毒 凋亡 -
胰岛素样生长因子1基因转染骨髓基质干细胞治疗裸鼠骨缺损
背景:众多的研究已证实胰岛素样生长因子1在成骨细胞的增殖、分化、基质合成中发挥重要的调控作用,并参与调节骨改建及修复的系列过程.目的:观察人胰岛祟样生长因子1基因修饰的骨髓基质干细胞对骨损伤修复的促进作用及能否构建出具有良好生物学活性的组织工程人工骨,提高骨缺损修复质量.设计、时间及地点:对比观察,实验于2004-03/2005-05在苏州大学实验动物中心完成.材料:体外将胰岛素样生长因子1基因通过反转录病毒转入骨组织工程种子细胞骨髓基质干细胞,并与具有良好生物学活性的脱钙骨荩质材料复合.方法:BalB/C裸鼠15只制备颅骨8 mm缺损模型,随机数字表法分为3组,每组5只.胰岛素样生长因子1转染细胞组和空载体细胞组将两种不同植入物脱钙骨基质/胰岛素样生长因子1转染细胞和脱钙骨基质/空载体细胞分别植入颅骨缺损部位,空白对照仅造模,不进行任何干预造模后4周处死动物,取出颅骨进行组织学观察.主要观察指标:①反转录-聚合酶链反应检检测转染细胞胰岛素样生长因子 1 mRNA的表达.同时收集转染后细胞上清,用蛋白免疫印迹检测重组胰岛素样生长因子1的表达.②扫描电镜观察细胞/基质材料复合物共培养3,6 d后的生长情况.⑨颅骨缺损模型大体观察.④苏木精-伊红染色观察造模后4周各组颅骨缺损的修复情况.结果:①经反转录-聚合酶链反应及蛋白免疫印迹检测,胰岛素样生长因子 1基因修饰的骨髓基质干细胞中有胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白的表达.②扫描电镜观察转染细胞与脱钙骨基质共培养3d时胰岛素样生长因子1转染细胞组脱钙骨基质材料表面已有大量细胞黏附并向深部空隙长入:6 d时脱钙骨基质表而黏附的细胞处已分泌出大量胶原纤维:而空载体细胞组各时间点黏附细胞数和胶原纤维产生量则均较少.⑨造模后4周各组植入物周围均无明显炎症反应,胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密:而空载体细胞组植入物可推动:空的对照组骨缺损处无新骨形成.④苏木精-伊红染色可见胰岛素样生长因子1转染细胞组植入物与颅骨缺损结合紧密,骨折缺损区有新骨及血管形成:空载体细胞组骨缺损区新骨形成较少:空白对照组缺损末见修复.结论:胰岛素样生长因子1转染的骨髓基质干细胞/脱钙骨基质复合物具有较好的骨缺损修复功能.
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反转录病毒载体介导转化生长因子β_1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达
背景:将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤.目的:以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β_1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响.方法:采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞.载体经PLNCX_2 Hind Ⅲ/Not Ⅰ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed_2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX_2-RFP.转化生长因子β_1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX_2-RFP连接,构建PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度.将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染:对照组(不做任何转染)、转染PLNCX_2组、转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化.收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β_1表达.结果与结论:重组基因PLNCX_2-TGFβ_1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ_1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX_2-TGFβ_1-RFP.转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×10~6CFU.稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功.持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃.转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX_2组(P<0.05),对照组、转染PLNCX_2组间差异无显著性意义.对照组与转染PLNCX_2组均无转化生长因子β_1表达,转染PLNCX_2-TGFβ_1-RFP组转化生长因子β_1质量浓度为(28.08±3.73)ng/L.提示反转录病毒载体PLNCX_2介导的人转化生长因子β_1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃.
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反转录病毒载体介导Indian hedgehog信号蛋白在C3H10T1/2细胞中的表达及成骨诱导潜能
背景:目前大量研究证实Indian hedgehog(Ihh)信号通路在骨发育中发挥着重要的调控作用.目的:克隆Ihh重组反转录病毒载体,观察Ihh在C3H10T1/2细胞中的表达及其成骨诱导效果.方法:采用分子克隆技术将Ihh基因与增强型绿色荧光蛋白基因克隆到反转录病毒载体pSFG上,包装出假病毒转染C3H10T1/2细胞,在共聚焦显微镜下观察其绿色荧光蛋白强度及转染效率.运用Western blot方法检测Ihh蛋白的表达,观察C3H10T1/2细胞形态学变化,碱性磷酸酶染色检测成骨活性.结果与结论:共聚焦显微镜下观察到大量的绿色荧光表达,Western blot检测结果显示Ihh基因及增强型绿色荧光蛋白基因在C3H10T1/2中呈显著共表达.在体外培养过程中,Ihh能诱导C3H10T1/2细胞形态学发生改变,增加碱性磷酸酶活性,提示Ihh具有诱导C3H10T1/2细胞向骨细胞分化的潜能.
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心肌营养素1分子的克隆及其反转录病毒载体的构建
实验于2005-10/2006-06在江苏省干细胞重点实验室进行.体外分离培养新生SD大鼠心室肌细胞2周后,Trizol法抽提细胞总RNA,RT-PCR获得心肌营养素1基因,与克隆载体PMD18-T-Vector连接,转化TOP10感受态细菌,阳性克隆经鉴定正确后,PCR扩增心肌营养素1基因,EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,T4DNA连接酶连接,构建pEGZ-CT-1的反转录病毒载体.经PCR及酶切鉴定,测序表明心肌营养素1基因成功插入pEGZ-Term载体.pEGZ-CT-1载体的构建,为转基因细胞的制备和移植治疗心肌梗死奠定了基础.
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反转录病毒介导人骨形态发生蛋白2基因修饰骨髓基质细胞的体内成骨效应
目的:构建人骨形态发生蛋白2反转录病毒表达载体,探讨以转人骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞为种子细胞的组织工程骨修复骨缺损的可行性.方法:实验于2001-05/2003-01在北京大学医学部完成.①采用DNA重组技术,将骨形态发生蛋白2cDNA克隆到pLXSN反转录病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,包装成为pLXSN/BMP2重组反转录病毒.取15 d龄BALB/c系小鼠5只用于骨髓基质细胞的提取.将重组病毒感染小鼠骨髓基质细胞,经筛选后,聚合酶链反应鉴定人骨形态发生蛋白2cDNA在转基因骨髓基质细胞中的整合情况.②转基因骨髓基质细胞的骨形态发生蛋白2表达情况采用免疫印渍杂交和核糖核酸印渍杂交技术检测.转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶的表达采用钙-钴法染色检测,用以评定表达骨形态发生蛋白2的生物活性.③取6周龄BALB/c小鼠6只,将转基因骨髓基质细胞与羟基磷灰石构建人工骨植于小鼠骨骼肌内,体内成骨情况予组织学观察评估.结果:①pLXSN/BMP2质粒的鉴定结果:经酶切及DNA测序证实重组pLXSN/BMP2序列正确.②重组病毒的滴度测定结果:包装的病毒滴度为(6～8)×105cfu/mL.③基因整合及表达的分析:聚合酶链反应证实转基因骨髓基质细胞基因组中有骨形态发生蛋白2 cDNA整合;核糖核酸印渍杂交和蛋白免疫印渍杂交证实转基因骨髓基质细胞稳定表达人骨形态发生蛋白2;钙-钴法染色证实转基因骨髓基质细胞碱性磷酸酶阳性.④小鼠体内成骨情况:甲苯胺蓝染色的组织切片镜下观察显示转骨形态发生蛋白2基因骨髓基质细胞构成人工骨可见少量软骨细胞及软骨基质存在,软骨细胞呈巢状分布.结论:成功地构建了pLXSN-BMP2重组反转录病毒载体,该载体不仅有效地表达骨形态发生蛋白2蛋白,表达的骨形态发生蛋白2能够诱导未分化的骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化,且在体内肌肉环境下能促进成骨.
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LMP-1基因转染骨髓间充质干细胞的LIM矿化蛋白表达
背景：体外实验提示LMP-1基因可提高骨质疏松性骨髓间充质干细胞LMP-1蛋白的表达。目的：用含有LIM矿化蛋白1基因的反转录病毒载体(RV-LMP-1-GFP)转染骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞，检测其对骨质疏松性骨髓间充质干细胞LIM矿化蛋白表达的影响。方法：随机取雌性SD大鼠12只，采用双侧卵巢切除法建立骨质疏松性大鼠模型，另取6只大鼠仅切除卵巢周围等量脂肪组织，保留卵巢为假手术组。喂养2个月后取双侧股骨、胫骨、肱骨分离培养其骨髓间充质干细胞。均取3代培养细胞随机分为去势组、LMP-1转染组(转染LMP-1基因)和假手术组。分别行RT-PCR及Western-Blot检测各组细胞LIM矿化蛋白1 mRNA和蛋白的表达。结果与结论：培养出骨质疏松性SD大鼠骨髓间充质干细胞，转染后倒置荧光显微镜下可见绿色荧光表达；3组细胞均可在基因及蛋白水平表达 LIM 矿化蛋白1。与假手术组及去势组比较，LMP-1基因转染组的LIM-1mRNA和蛋白的表达均升高显著(P<0.05)，假手术组与去势组之间差异无显著性意义(P>0.05)。成功实现重组 RV-LMP-1-GFP 基因在骨质疏松性 SD 大鼠骨髓间充质干细胞中 mRNA 和蛋白水平的表达，且LMP-1的表达水平显著提高。结果表明重组LMP-1基因成功导入骨质疏松性大鼠骨髓间充质干细胞基因组中，并使得LMP-1 mRNA和蛋白的表达明显提高。
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雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响
背景：雌激素受体β基因参与骨代谢的研究较少，其对骨代谢的具体调节机制仍不清楚。目的：分析雌激素受体β基因沉默对人成骨细胞转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。方法：实验分3组：空白对照组(即hFOB 1.19，未感染任何反转录病毒)、阴性对照组(即含无效干扰片断雌激素受体β-shRNA-nc)、佳RNAi组(即ERβ-shRNA-3)。将前期佳RNAi组的雌激素受体β-shRNA反转录病毒载体感染人成骨细胞，通过抗性筛选并扩大培养，利用MTT法检测雌激素受体β稳定抑制后对细胞增殖的影响；随后在雌激素干预下，通过Western blot技术检测雌激素受体β蛋白表达的稳定抑制效率，并使用半定量RT-PCR和Western blot技术检测雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2表达的影响。结果与结论：①成功筛选出稳定感染ERβ-shRNA-3反转录病毒载体的人成骨细胞，MTT法检测显示雌激素受体β稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P>0.05)；②在雌激素干预下，雌激素受体β蛋白的抑制率为(93.11±0.57)%(P<0.05)，且雌激素受体β稳定抑制后对转化生长因子β1 mRNA和蛋白的上调率分别为(26.65±3.81)%和(23.79±3.76)%，骨形态发生蛋白2 mRNA和蛋白的上调率分别为(16.62±1.71)%和(18.08±3.20)%(均P<0.05)；③结果提示雌激素受体β可能通过调控转化生长因子β1和骨形态发生蛋白2的表达在骨代谢中发挥作用。
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反转录病毒感染与肿瘤发生
病毒感染与癌症的关系是生物医学领域中非常重要的研究方向,估计当前全世界至少20%人类肿瘤的发生与病毒感染有密切联系.本文对反转录病毒诱发肿瘤的各种作用机制进行了详细阐述.根据致病速度的快慢,反转录病毒被分为两大类:能迅速诱导肿瘤产生的急性转化反转录病毒和缓慢诱导肿瘤产生的非急性转化反转录病毒.急性转化反转录病毒通过其自身携带的癌基因快速诱导肿瘤产生,而细胞原癌基因的插入激活则是非急性转化反转录病毒引起肿瘤的主要机制.对反转录病毒致瘤机制的研究揭示了肿瘤发生过程中的一些重要原理和机制,包括原癌基因激活以及肿瘤抑制基因失活等,对探讨非病毒引起的人类肿瘤的发生机制同样具有重要的参考意义.
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反转录病毒介导端粒酶基因对人口腔黏膜角化细胞寿命的影响
目的:以pBABE-tert重组反转录病毒为载体,介导端粒酶反转录酶基因(hTRT)转染体外培养的人口腔角化细胞,探讨端粒酶对细胞寿命的影响.方法:将含有hTRT的pBABE-tert重组反转录病毒载体扩增后,转染体外培养的人口腔角化细胞,挑选阳性克隆进行传代培养,以PCR-ELISA和PCR-PAGE电泳检测端粒酶活性.结果:获得端粒酶活性稳定表达的口腔角化上皮细胞克隆,寿命可延长至8～9代.结论:转导端粒酶反转录酶基因的人口腔角化细胞寿命延长1倍,但不能永生化,说明人口腔上皮角化细胞的永生化是复杂和多点调控的过程,端粒酶活性增加是细胞永生化的关键但不是唯一原因.
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人骨形成蛋白-4反转录病毒体系的构建及裸鼠肌内成骨实验
目的:建立hBMP-4反转录病毒体系,为BMP-4基因治疗在骨组织工程中的应用提供研究平台.方法:应用亚克隆方法构建pLEGFp-hBMP-4真核表达载体,脂质体介导下转染PA317细胞,包装病毒颗粒.收集病毒上清,感染NIH3T3细胞系,测定滴度.以同样方法转染、包装获得了绿色荧光蛋白LEGFP反转录病毒,作为实验对照.将实验组和对照组病毒液分别注射至4只裸鼠肌内,8周后取材,组织学检查,鉴定成骨的效果.结果:成功构建了pLEGFP-hBMp-4载体.转染包装细胞后,获得了较高滴度的LEGFP-hBMP-4和LEGFP反转录病毒颗粒.裸鼠肌内注射后8周,hBMP-4病毒注射部位有新生骨块形成,而EGFP组则未见新生骨块.结论:成功建立了LEGFP-hBMP4反转录病毒体系,为利用BMP-4基因治疗进行骨修复的研究提供了反转录病毒工具.
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肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞
目的 重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞.方法 包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞.结果 诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2.结论 肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台.
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新基因mgt-16反转录病毒载体的构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达
目的 构建表达小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并观察其在小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10T1/2(简称10T1/2细胞)中的表达.方法 以含小鼠新基因mgt-16的DNA序列为模板PCR扩增得到mgt-16编码序列,T-A克隆后测序获得pMD18T-16质粒,与真核表达载体pEGFP-N1酶切、连接、转化,通过PCR、酶切鉴定和测序获得正确的pEGFP-N1-16载体.将pEGFP-N1-16载体中含mgt-16的片段克隆至反转录病毒载体pLEGFP-N1,通过酶切鉴定和测序获得正确的pLEGFP-N 1-16反转录病毒载体.将pLEGFP-N1-16转染反转录病毒包装细胞Phoenix,制备携带mgt-16与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的反转录病毒,感染小鼠间充质干细胞10T1/2后,400 μg/mL G418筛选获得稳定表达mgt-16与EGFP融合蛋白的10T1/2细胞克隆.荧光显微镜观察MGT-16蛋白的表达及亚细胞定位.结果 PCR扩增得到大小约300 bp的mgt-16条带,T-A克隆后测序显示获得的mgt-16序列与Genbank数据库序列相同.构建的pEGFP-N1-16载体经PCR、酶切鉴定和测序验证构建成功,构建的反转录病毒载体pLEGFP-N1-16经酶切鉴定和测序验证构建成功.荧光显微镜观察MGT-16主要在Phoenix细胞和小鼠间充质干细胞的细胞质表达,核周表达水平较高.结论 成功构建了小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并在间充质干细胞中表达,为进一步研究新基因mgt-16在间充质干细胞中的功能奠定了基础.
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人肌细胞增强因子2A基因病毒载体构建及嗜铬细胞瘤PC12稳转细胞系的建立和鉴定
目的 构建表达肌细胞增强因子2(MEF2)A基因的反转录病毒载体,并观察稳定感染嗜铬细胞瘤PC12细胞后MEF2A蛋白的表达情况.方法 用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pcDNA3-MEF2A-flag质粒,得到MEF2-flag基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化后获取反转录病毒颗粒.将反转录病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出.采用Western印迹法检测MEF2-flag的表达情况.结果 连接重组后经酶切和测序筛选出pBabe-MEF2A-flag.转染pBabe-MEF2A-flag的PC12的细胞组中MEF2A的含量为2.03±0.06,显著高于空载体对照组的1.00±0.04(P＜0.01).结论 成功构建pBabe-MEF2A-flag反转录病毒载体,并建立了其稳定转染的PC12细胞系.
