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益母草碱对肥大心肌细胞p38MAPK及下游基因表达的影响研究
目的:探讨益母草碱对肥大心肌细胞p38MAPK及下游基因表达的影响.方法:以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导肥大心肌细胞,在此基础上给予p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂(SB203580,10 μmol/L)及低、中、高浓度益母草碱(5、10、20 μmol/L)干预.分别以[3H]亮氨酸掺入量、酶联免疫吸附测定(ELISA)和硝酸还原酶法检测心肌细胞蛋白质合成速率以及细胞上清B型利钠肽(BNP)、内皮素-1(ET-1)、AngⅡ和一氧化氮(NO)含量;Real-time PCR法检测心肌细胞ET-1、p38MAPK、肌细胞增强因子2(MEF2)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)、α-肌球蛋白重链(α-MHC) mRNA的表达水平.结果:与模型组比较,高剂量益母草碱组心肌细胞蛋白质合成速率、BNP、ET-1及AngⅡ含量明显降低(P＜0.05),同时ET-1、p38MAPK、MEF2、β-MHCmRNA表达水平明显下调(P＜0.05),而NO含量和α-MHC mRNA表达水平明显上调(P＜0.05).结论:高剂量益母草碱(20 μmol/L)可能通过调节p38MAPK及下游基因表达逆转心肌细胞肥大.
关键词： 益母草碱 心肌细胞肥大 p38丝裂原活化蛋白激酶 肌细胞增强因子2 -
有氧训练大鼠腓肠肌组织微小RNA-133a和肌细胞增强因子2的表达
背景:研究表明微小RNA-133a、肌细胞增强因子2和成肌分化抗原可调解骨骼肌的分化与重塑.目的:观察有氧训练对腓肠肌微小RNA-133a、肌细胞增强因子2和成肌分化抗原表达的影响.方法:将SD大鼠随机分为对照组和有氧训练组,有氧训练组采用大鼠跑台运动模型,而对照组不进行运动训练.训练4,6周后采集各组大鼠腓肠肌组织,并称取腓肠肌的质量,实时定量PCR检测骨骼肌中肌球蛋白、微小RNA-133a、肌细胞增强因子2与成肌分化抗原mRNA的表达,并采用免疫组织化学的方法检测腓肠肌Ⅱ型肌纤截面积的改变.结果与结论:训练4,6周,有氧训练组大鼠腓肠肌的相对质量以及肌球蛋白重链-Ⅱa的表达水平较对照组显著增加(P < 0.05或P < 0.01),Ⅱ型肌纤维横截面积即显著增大(P < 0.05),其微小RNA-133a和肌细胞增强因子2 mRNA的表达较对照组显著升高(P < 0.05,P < 0.01),而成肌分化抗原mRNA的表达在各组间差异均无显著性意义.证实,有氧训练可上调大鼠腓肠肌组织微小RNA-133a、肌细胞增强因子2 mRNA的表达.
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肌细胞增强因子-2在兔后肢动脉侧支血管形成过程中的表达
目的:检测肌细胞增强因子2(MEF-2)在兔后肢侧支血管形成过程中的表达.方法:结扎兔左侧股动脉,术后1周和4周分别处死动物,冰冻切片进行MEF-2和Ki67(细胞增殖标志物)免疫荧光染色,共聚焦显微镜观察.结果:正常血管MEF-2仅在中膜有微弱表达;在生长发育的侧支血管壁,MEF-2全层的表达均显著增强;而在发育成熟的侧支血管MEF-2的表达接近于正常血管水平.Ki67和MEF-2的双重免疫组化显示二者在细胞中的表达有重叠.结论:在兔后肢动脉生成过程中MEF-2表达上调,可能通过参与细胞的增殖及MCP-1的调节促进侧支血管生成.
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肌细胞增强因子2A与肝星状细胞活化关系的体内实验研究
背景:转录调控在肝星状细胞(HSC)活化过程中起重要作用,研究显示转录因子肌细胞增强因子2(MEF2)参与了HSC的活化过程.目的:探讨肝纤维化形成过程中MEF2家族成员MEF2A与HSC活化的关系.方法:实验开始时处死6只大鼠作为0周对照组,64只大鼠随机分为正常对照组和肝纤维化模型组.模型组大鼠皮下注射60%CCl4(0.3 ml/100 g,每周2次)复制肝纤维化模型;正常对照组大鼠与模型组于相同条件下饲养,不予任何处理.造模开始后3、6、9、12周分批处死大鼠,取肝组织,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测MEF2A mRNA表达,蛋白质印迹法检测MEF2A蛋白和HSC活化标记物α-平滑肌肌动蛋向(α-SMA)表达,Van Gieson染色定量分析肝内胶原含量.结果:正常肝组织中仅有少量MEF2A mRNA和蛋白表达;随着肝纤维化的形成,肝组织MEF2A mRNA和蛋白表达量逐渐增加(P<0.05),MEF2A与α-SMA蛋白表达呈正相关(r=0.88,P<0.05).肝内胶原含量随肝纤维化的形成呈递增趋势(P<0.01).结论:MEF2A参与了 CCl4诱导的大鼠肝纤维化形成过程中HSC的活化和增殖.
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人肌细胞增强因子2A基因病毒载体构建及嗜铬细胞瘤PC12稳转细胞系的建立和鉴定
目的 构建表达肌细胞增强因子2(MEF2)A基因的反转录病毒载体,并观察稳定感染嗜铬细胞瘤PC12细胞后MEF2A蛋白的表达情况.方法 用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pcDNA3-MEF2A-flag质粒,得到MEF2-flag基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化后获取反转录病毒颗粒.将反转录病毒颗粒感染PC12细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出.采用Western印迹法检测MEF2-flag的表达情况.结果 连接重组后经酶切和测序筛选出pBabe-MEF2A-flag.转染pBabe-MEF2A-flag的PC12的细胞组中MEF2A的含量为2.03±0.06,显著高于空载体对照组的1.00±0.04(P＜0.01).结论 成功构建pBabe-MEF2A-flag反转录病毒载体,并建立了其稳定转染的PC12细胞系.
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小干扰RNA对缺氧PC12细胞中肌细胞增强因子2A蛋白表达的影响
目的 研究小干扰RNA(siRNA)对大鼠缺氧PC12细胞中肌细胞增强因子2A(MEF2A)蛋白表达的影响.方法 常规培养和缺氧培养PC12细胞.设计合成和筛选针对MEF2A的siRNA序列(MEF2A-siRNA),构建真核细胞表达载体,用脂质体介导转染PC12细胞.实时荧光定量PCR法检测MEF2A的mRNA表达水平.Western blot检测MEF2A蛋白表达量.结果 在用含有MEF2A基因的靶向抑制序列MEF2A-siRNA转染后PC12细胞中MEF2A mRNA相对表达量(2~(-△△CT))为(0.12±0.03),显著低于常规培养的PC12细胞中的表达量(1.01±0.02),抑制率为88.1%(P＜0.01).Western blot检测表明缺氧组中MEF2A蛋白表达量为(98.4±11.7),显著高于正常对照组的(47.5±7.6)(P＜0.01).与缺氧组相比, MEF2A-siRNA+缺氧组中MEF2A蛋白量下调为(59.3±8.4)(P＜0.01),表明MEF2A-siRNA转染对缺氧诱导PC12细胞中MEF2A蛋白表达的上调有显著抑制作用.结论 缺氧诱导PC12细胞中MEF2A的表达升高,而siRNA转染可以靶向抑制MEF2A基因表达.
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氯胺酮通过MEF2信号通路调节发育期神经元突触生长及突触重塑
目的 探讨氯胺酮不同暴露时间下对发育神经元肌细胞增强因子2(MEF2)信号通路及突触生长相关蛋白synapsin Ⅰ表达影响.方法 新生5d龄SD大鼠,随机分为2,4,6和24h氯胺酮组(T组)和对照组(C组).将新生5d SD大鼠皮下注射氯胺酮(20 mg·kg-1)干预.对照组不做任何处理.干预后在各对应时间点提取海马神经元总RNA,利用real-time PCR进行定量分析MEF2信号通路(MEF2 mRNA、synGAP Ⅰ mRNA和Arc mRNA)及突触形成相关基因synapsin Ⅰ mRNA表达水平.结果 与C组相比,用氯胺酮干预后时间依赖性下调海马神经元MEF2 mRNA、synGAP ⅠmRNA、Arc mRNA(P＜0.05).Synapsin Ⅰ mRNA表达则时间依赖性上调(P＜0.05).麻醉后24 h恢复正常.结论 氯胺酮短暂下调MEF2信号通路而上调svnapsin Ⅰ表达,其机制可能是Arc表达上调增加突触数目以致synapsin Ⅰ表达上调.
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MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响
目的 研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制.方法 采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939~+531bp)(1470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C>T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性.数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较.结果 成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P<0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356~-108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1生成;预测发现正常MEF2C基因启动子片段上存在2个CpG岛,2个突变组预测没有发现CpG岛数目的变化,但位置发生变化.结论 MEF2C基因启动子区M1突变、M2突变均能提高转录活性,这2种突变导致启动子区转录因子结合位点数目、CpG岛位置的改变,这些变化可能与新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病的发病机制有关.
