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大肠杆菌双杂交系统筛选与AMPKα2相互作用的蛋白质
目的 利用大肠杆菌双杂交系统筛选脑组织中与大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-activated protein kinase α2,AMPKα2)相互作用的蛋白质,以期进一步探讨AMPKα2在脑内的生物学功能及调节机制.方法 以重组质粒pBT-AMPKα2作为诱饵,应用大肠杆菌双杂交系统筛选大鼠胎脑cDNA文库,并对结果进行生物信息学分析.结果 筛选出与AMPKα2结合的蛋白7个,包括聚合泛素、热休克蛋白8(heat shock protein 8, HSP8)、磷酸果糖激酶、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunit Ⅰ, COXⅠ)、人类白细胞抗原B关联性转录物3 (HLA-B-associated transcript 3,BAT3)异构体1、蛋白酪氨酸磷酸酶受体型D(protein tyrosine phosphatase receptor type D, Ptprd)、岛-脑蛋白1(islet-brain1,IB1).结论 寻找到了脑内与AMPKα2相互作用的7种蛋白:聚合泛素、HSP8、磷酸果糖激酶、COXⅠ、BAT3异构体1、Ptprd、IB1.
关键词： AMP激活的蛋白激酶 大肠杆菌双杂交 蛋白质相互作用 -
AMP激活的蛋白激酶α2大肠杆菌双杂交诱饵重组质粒的构建及鉴定
目的 构建大肠杆菌双杂交系统的诱饵重组质粒.方法 PCR扩增大鼠AMP激活的蛋白激酶α2(AMP-activated protein kinase α2,AMPKα2)蛋白编码区cDNA,与大肠杆菌双杂交表达载体pBT构建融合蛋白表达质粒pBTAMPKα2.经酶切和测序鉴定后,将pBT-AMPKα2转化XL-1 Blue MRF'大肠杆菌报告菌株,检测诱饵融合蛋白的表达.并用pBT-AMPKα2和pTRG空载体共转化XL-1 Blue MRF'菌株,通过3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)选择性筛选平板检测诱饵融合蛋白的自激活作用.结果 酶切和测序结果表明AMPKα2蛋白编码序列成功克隆入pBT载体,融合区阅读框正确.诱饵重组质粒pBT-AMPKα2能表达λcL/AMPKα2融合蛋白.转化有pBT-AMPKα2和pTRG空载体的XL-1 Blue MRF'大肠杆菌报告菌株在3-AT选择性筛选平板上不生长,而在no 3-AT非选择性筛选平板上生长良好,表明pBT-AMPKα2重组质粒能在大肠杆菌细胞中正确表达且无自激活作用.结论 构建的pBT-AMPKαt2诱饵重组质粒可用于下一阶段的cDNA文库筛选.
关键词： AMP激活的蛋白激酶 大肠杆菌双杂交 诱饵质粒 -
PGC-1α基因MEF2C结构域482G/A变异参与2型糖尿病发病的机制研究
目的 了解中国人PGC-1α基因肌肉增强因子2C(muscle enhance factor 2C,MEF2C)结构域内的482G/A变异与2型糖尿病的关系,探讨该位点变异对PGC-1α与其生物学配体MEF2C间结合力的影响,评估PGC-1 a-MEF2C-GLUT4通路参与糖尿病发病的可能性.方法 从350例2型精尿病先证者及其一级亲属外周血抽提DNA.应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析结合DNA直接测序技术鉴定PGC-1α基因型.基于2型糖抹病家庭,采用单倍型相对危险度分析(haplotype relative risk,HRR)和传递不平衡检验(transmission disequilibrium test,TDT)分析482G/A变异与2型糖尿病的相关性.大肠杆菌双杂交实验定性、定量检测482位点变异所导致的PGC-1α与其配体MEF2C问结合力的变化.结果 HRR分析显示,在2型糖尿病家系中,基于等位基因,传递与未传递组比较,PGC-1α基因482G/A变异的A等位基因由父母更多地向患者传递,差异具有统计学意义(X2=7.2170,P=0.0072,HRR=1.4496);TDT-扩展传递不平衡检验分析显示482A等位基因由杂合子父母传递给患病子代的频率显著偏离0.5(219个家庭,P=0.0310;350个家庭,P=0.0292).大肠杆菌双杂交实验显示482A可引起PGC-1α与其配体MEF2C间结合力明显下降(62.1±8.97,P＜0.05).结论 482A变异可能增加了中旧人患2型糖尿病的风险,这一作用可能是通过降低PGC-1α-MEF2C-GLUT4通路活性,进而影响骨骼肌对葡萄糖摄取而实现的.
