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sCD40LIg重组腺病毒载体的构建鉴定和体外表达
目的构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40LIg)基因的重组腺病毒载体,为下一步在动物模型体内表达和基因治疗提供基础.方法分别以质粒pAdCTLA4Ig和pGEM-T-easy-sCD40L为模板,通过PCR扩增获得人源IgGFc和sCD40L基因全部序列.分别回收用连接酶连接,以连接产物为模板PCR,获得sCD40LIg基因全部序列,插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV的启动子下游BglⅡ及XhoⅠ位点之间,获得重组质粒pAdTrack-sCD40LIg.将正确重组体pAdTrack-sCD40LIg转化含腺病毒骨架质粒的pAdEasy-1-BJ5183细菌行同源重组.提取重组成功质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因,Western blot分析蛋白表达等方法鉴定重组的腺病毒.结果成功构建了含有sCD40LIg基因的重组腺病毒并在体外表达.结论该重组腺病毒的构建为下一步研究其在哺乳动物细胞内表达及在移植排斥的基因治疗中的作用提供了一定的基础.
关键词： sCD40L融合蛋白 重组腺病毒 基因表达 免疫耐受 -
人sCD40L-Ig重组腺病毒载体的构建、表达及功能检测
目的: 构建含有分泌型人胞外区CD40L融合蛋白(sCD40L-Ig)基因的重组腺病毒载体,确定其表达和功能学意义.方法: 通过PCR获得人源IgGFc和sCD40L基因并予以连接,将其插入到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中, 构建重组质粒pAdTrack-sCD40L-Ig.将其与pAdEasy-1-BJ5183菌行同源重组后,用293细胞包装,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)和Western blot分析等方法鉴定重组腺病毒,并进行双向混合淋巴细胞反应(MLR)以确定其功能.结果: 所构建的sCD40L-Ig基因的重组腺病毒, 经酶切和PCR鉴定正确.原代腺病毒的滴度达到2.69×1011 pfu/L, 并有相对分子质量(Mr)为61×103的目的蛋白表达.MLR显示,重组腺病毒对淋巴细胞的增殖有抑制作用.结论: 成功地构建了含有sCD40L-Ig基因的重组腺病毒,并对MLR有抑制作用.
关键词： sCD40L融合蛋白 重组腺病毒 混合淋巴细胞培养 免疫耐受
