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广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析
目的从2002年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒, 明确流行株的血清型及基因型,并鉴定该分离株的毒力.方法采集疑似登革热患者血清20份,应用C6/36细胞体外培养的方法进行病毒分离,并合成登革病毒通用引物,进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR) 后,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对.确定血清型后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E/NS1连接区基因片段,测序后用邻位相连(N-J)法构建登革病毒进化树,分析此次登革病毒流行株的来源.通过乳鼠脑内接种及空斑实验,测定分离株的毒力.结果上述20份血清标本中,5份标本出现明显的细胞病变,主要表现为细胞融合,形成大小不一的空泡和网状结构.RT-PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型.E/NS1连接区基因序列片段分析表明,2002年广州分离株(DEN-1/GZ2002)的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN-1/T14株(澳大利亚,1981)同源性高,达98%.N-J法构建进化树显示:11株DEN-1病毒分成3个基因群,分别与Rico-Hesse 1990分型中的Ⅰ, Ⅳ和Ⅴ型以及Ana P. Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美洲/非洲型相符,本室分离的DEN-1/GZ2002株属于Ⅳ型或者称南太平洋型.DEN-1/GZ2002株脑内接种乳鼠11 d左右导致乳鼠弓背,后肢麻痹、瘫痪,直至死亡.感染Vero细胞8 d后可见小而不透明的空斑,病毒滴度可达106 pfu/ml,TCID50为 4.37 log pfu/0.2 ml.结论 2002年广州登革热流行为登革病毒Ⅰ型感染所致,病毒基因型为Ⅳ型,本实验虽然未明确毒力相关基因,动物实验及细胞感染实验证实该分离株的毒力较弱.
