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家蚕蚕蛹过敏原表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析
目的 克隆表达家蚕蚕蛹表皮蛋白RR-2基序63前体(CPR63)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析.方法 合成家蚕蚕蛹CPR63蛋白的基因(ref|NM_001173223.1|),将其连接至克隆载体pMD 18-T,pMD18-T-CPR63阳性质粒与原核表达载体pET-44a分别用限制性内切酶酶切,构建出重组表达质粒pET-44a-CPR63,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;Western blot检测重组CPR63蛋白特异性过敏原性;用clustalw2和MEGA5工具包进行同源性分析;用ProtParam Tools预测其理化性质;用PSIPRED和SWISS-MODEL预测其蛋白质结构.利用网络服务器IEDB、Preprod和DNAStar,对CPR63蛋白T、B细胞抗原表位进行预测.结果 经测序鉴定,本研究成功克隆出了家蚕蚕蛹CPR63基因,其开放阅读框549 bp,编码182组氨基酸.通过大肠杆菌E coli BL21 (DE3)表达CPR63重组蛋白主要以可溶性形式存在,相对分子质量约20000.Western blot显示重组CPR63能够与家蚕蚕蛹过敏患者血清IgE结合.家蚕蚕蛹CPR63蛋白与黑脉金斑蝶表皮蛋白RR-2基序63 (gb|EHJ69818.1|)同源性为85％.系统进化树结果显示家蚕蚕蛹与小菜蛾亲缘关系比较近.理化性质预测显示CPR63蛋白质较稳定.二级结构及三级结构预测结果显示CPR63的结构主要以无规则卷曲组成.T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(5～13、20～28、51～59和87～95).B细胞抗原表位预测得到4个肽序列(21～40、37～56、47～66和64～83).结论 成功克隆并表达了家蚕蚕蛹CPR63,并证实重组CPR63蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究家蚕蚕蛹过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础.
