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人g2型溶菌酶的多克隆抗体制备及其在睾丸中的表达分析
目的 以真核表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,LysG2)为免疫原制备抗LysG2的兔多克隆抗体,检测LysG2在睾丸组织中的定位,为阐明其生理功能提供线索.方法 对LysG2毕赤酵母GS115转化菌株进行高密度培养,甲醇诱导目的蛋白表达并通过甲壳素亲和色谱纯化,以重组蛋白为免疫原制备兔抗LysG2多克隆抗体.通过ELISA检测抗体效价后,对人体各组织、精子及精液标本进行Western印迹分析,并对人睾丸组织进行免疫组化检测.结果 以毕赤酵母表达LysG2为免疫原制备的抗体具有高效价,表达谱分析表明LysG2在睾丸中有表达,在精子蛋白提取物中没有检测到其存在,在精浆中检测到了LysG2.免疫组化检测结果显示LysG2在睾丸中主要定位于间质组织的Sertoli细胞.结论 本研究成功以真核表达的LysG2制备了该蛋白多克隆抗体,LysG2在睾丸Sertoli细胞有表达,并分泌到精浆中,提示LysG2可能在男性生殖系统先天性免疫中发挥作用.
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甲壳素亲和层析在人g2型溶菌酶制备中的应用
目的 制备甲壳素亲和纯化介质,设计有效的纯化技术路线,对毕赤酵母表达的人g2型溶菌酶(human goose-type lysozyme 2,HLysG2)重组蛋白进行纯化.方法 研究碱化、稀酸处理、碱化时间、碱浓度等各种因素对甲壳素介质性能的影响;对重组毕赤酵母进行甲醇诱导表达,依次采用亲和层析、阴离子交换层析、透析等方法从发酵液上清中纯化HLysG2,对终纯化产物的纯度使用HPLC进行测定,杀菌活性使用双层琼脂平板扩散法进行测定.结果 经处理后,在常压下甲壳素亲和介质洗脱速度可达4.5 ml/(min· cm2),对HLysG2吸附容量为1.8 mg/ml,总活性的收率为76.5％,得到的HLvsG2纯度＞99.0％,对溶壁微球菌具有杀灭活性.结论 制备的甲壳素亲和介质具有良好性能,以甲壳素亲和层析为中心的纯化方法可有效纯化HLysG2,为规模化制备HLysG2奠定了基础.
