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病原微生物的体内诱导基因及相关研究方法简介
为适应复杂多变的宿主体内环境,病原微生物入侵宿主后常会调整自身基因表达,启动一系列在体外环境生存时非必需蛋白质的表达以确保其在宿主体内的存活、增殖甚至致病.这类仅在病原微生物进入宿主体内后才被诱导表达而在体外生长时不表达的独特基因称为体内诱导基因(in vivo induced gene,ivi gene).大量研究表明,Ivi gene往往与病原菌在宿主体内的生存和致病密切相关,是抗菌药物、诊断试剂及疫苗设计及研究的良好靶标.为找寻和鉴定病原菌的ivi gene,人们成功发展了多种研究方法和手段,包括依赖动物模型的信号标签突变技术(signature-tagged mutagenesis,STM)、体内表达技术(in vivo expres-sion technology,IVET)、差异荧光诱导技术(differential fluorescence induction,DFI)及不依赖感染动物模型的体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology,IVIAT)等.本综述即针对ivi gene及其相关研究方法的原理、运用和优缺点进行简单的介绍.
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肺炎链球菌体内启动子诱捕文库的构建与初步分析
构建肺炎链球菌体内启动子诱捕文库(promoter-trap library),用于筛选肺炎链球菌体内诱导的基因.以穿梭质粒pEVP3为骨架,将无启动子的galU基因作为体内报告基因定向克隆到pEVP3上,与无启动子的体外报告基因lacZ基因融合,构建用于筛选体内诱导基因的载体pEVP3-galU;再把肺炎链球菌基因组DNA的随机酶切片段(200～500bp)克隆到此载体galU基因上游的Bgl II位点,构建了启动子诱捕文库,并转化肺炎链球菌galU缺陷菌株,获得相应的菌株库.文库大约覆盖基因组全长的5倍,插入率达到90%以上,保持了较高的复杂性.对得到的约450 000个肺炎链球菌转化子进行体内、外初步分析,那些从小鼠体内分离出的细菌,并在X-gal平板上为白色的菌落表明galU报告基因上游含仅在体内表达的启动子,提示所构建的启动子诱捕文库可用于筛选肺炎链球菌的体内诱导基因.
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痢疾菌体内诱导基因表达文库的构建
目的构建筛选痢疾菌福氏2a体内诱导基因的融合基因表达文库.方法以自杀载体pGP704为骨架,用氯霉素乙酰转移酶基因作为报告基因,构建了用于筛选体内诱导基因的载体pGPcat.把痢疾菌福氏2a基因组DNA的随机酶切片段(0.6-1kb)亚克隆到pGPcat载体报告基因上游的Bgl Ⅱ位点,构建了融合基因文库.结果与痢疾菌福氏2a 2457T结合转移后,获得融合基因表达文库.以氯霉素为选择标记,经过体外初步筛选,得到3.2%的具有氯霉素抗性的菌株.结论构建的融合基因表达文库适用于筛选福氏2a痢疾菌的体内诱导基因.
