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消化后片段长度差异等位基因特异性PCR技术--印记SNP rs220028多态性和甲基化模式研究
目的建立一种能同时分析甲基化和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)的新方法. 方法以印记SNP rs220028(A/G)为例,基因组DNA经甲基化敏感限制酶消化后用片段长度差异等位基因特异性PCR(fragment length discrepant allele- specific PCR,FLDAS-PCR)分型;用扩增产物酶消化法来排除酶切位点序列变异,证实检出的是甲基化等位基因.结果消化后FLDAS-PCR可选择性检出甲基化等位基因,家系分析表明其来自母亲.等位基因频率A=0.5085,G=0.4915,多态信息含量为0.3749. 结论消化后FLDAS-PCR技术可以实现甲基化和SNP的复合分析;印记SNP rs220028在 Prader-Willi/Angelman 综合征诊断中有潜在意义.
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单管一步甲基化可变位点分析技术
目的 建立单管一步甲基化可变位点(methylation variable position,MVP)分析技术——单管消化后PCR链融解曲线分析(post-digestion PCR-melting curve analysis,PDP-MCA). 方法 以文献报道的差异甲基化区(differentially methylated region,DMR)为模型,在MVP两侧设计一组解链温度各不相同的引物.应用FastDigest甲基化敏感性限制酶(methylation-sensitive restriction enzyme,MSRE),在同一反应管内顺次进行DNA的酶切、复合扩增和MCA检测,生成MCA图谱.同时用该方法和传统的MSRE-PCR MCA技术检测相同样品(外周静脉血、精液、阴道液各5份),比较两种方法检测结果,验证其可行性,并分析比较不同样品的MCA/HRM图谱.结果 解链温度相差2℃以上的片段,MCA峰分离良好,复合扩增后可以用MCA技术检测.应用单管PDP-MCA技术,可以集酶切、扩增和检测三步于一管,在2h内得到与传统方法一致的特异性图谱和数据,并实现样品的快速分类鉴别. 结论 单管PDP-MCA技术可以实现多个MVP的单管、闭管检测,具有简便、快速、易于自动化等优点,可用于样品DNA甲基化差异的检测.
