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用PCR-SSP技术检测弱D型RHD基因1例
RhD抗原(ISBT004.001；RH1)是一种由RhD蛋白携带的非常重要的血型抗原，是引起新生儿溶血病的主要原因［1］。极少数人红细胞的D抗原表达数目减少，被称之为弱D(以前叫作DＵ)，在白种人中的比例为0.2%～1%，在黄种人中的比例则更低。一部分弱D被解释为RhD蛋白的质的变化，称之为部分D，通常是由RHD／RHCE杂化基因引起，另一部分弱D是由Cde单倍体反式位置的抑制作用引起，这些弱D可能有正常的RHD基因，其RhD抗原表达只是微量减少，被宽松地称之为高级DＵ，现在常被定为正常的RhD。近笔者发现1名供血者红细胞为弱D型，且实验结果显示弱D型具有独特的基因结构，现报告如下。1 对象与方法1.1 研究对象献血者，男，21岁，汉族，在校学生，来本中心献血时被确定为弱D；阴阳性对照血样亦均取自本中心献血者，民族为汉族。1.2 序列特异性引物针对RHD和RHCE基因之间具差异的区段设计多对不同引物，特异性地扩增RHD基因的第2～7，9，10外显子和RHCE基因的第1，2，4，5外显子，以及RHD和RHCE基因的第4内含子(表1)。另以人类生长激素(HGH)基因序列特异性引物作为内对照引物，扩增片段为429bp(以上引物均由美国G&T公司合成、纯化及鉴定)。1.3 基因组DNA的制备使用美国G&T公司基因组DNA抽提试剂盒，采用盐析法从供血者外周血分离获得。0.3ml EDTA抗凝外周血加入1 ml红细胞裂解液，离心弃上清，沉淀加入170μl核裂解液及4μl SDS，剧烈振荡，再加入72μl NaCl溶液，10000r/min离心5min，取上清加入210μl异丙醇沉淀DNA，将DNA溶于100μl TE溶液中，保存待用。1.4 特异性PCR扩增反应体系11μl,含1μl DNA,8μl引物混合物，1U Taq酶。扩增条件为95℃预变性5min，95℃变性30s,60℃退火30℃s，72℃延伸90s,30循环。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳时间为25min。
