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EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立
目的 建立以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测猪细小病毒(PPV)的方法,为血液制品中病毒去除效果的工艺验证提供高效准确的技术平台.方法 根据PPV的VP2基因保守序列,设计并合成引物.对目的片段进行PCR扩增,将扩增的PPV病毒VP2基因片段克隆入PMD19-T载体,重组质粒PMD19-T-VP2经测序鉴定正确后,作为标准品模板,用于标准曲线的绘制和该实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异性和重复性检测的材料.结果 应用重组质粒PMD19-T-VP2制作的荧光定量PCR扩增曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系;该方法检测灵敏度的下限能达到102copies/μl;与其他DNA病毒和同种属的细小病毒无明显的交叉反应;连续重复检测高、中、低浓度样品,批内批间变异系数小,重复性好.结论 以EvaGreen为染料的实时荧光定量PCR检测PPV的方法提高了检测灵敏度,缩短了工艺验证的时间.
