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顺式反应元件文献资料
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用于筛选顺式反应元件的慢病毒启动子报告载体随机文库的构建
目的 建立含有随机序列与miniCMV融合的启动子,驱动抗生素耐药基因的表达;用于筛选和寻找不同处理条件下的反应性元件.方法 设计针对Puromycin抗性基因,即嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因(puromycin N-acetyltransferase gene,PAC)的引物,扩增目的条带并通过PacI+ Pme1限制性内切酶克隆至目的载体pWPI;然后,设计并合成接头序列+20N随机序列+miniCMV的融合片段,通过PCR的方法得到双链序列,并进行酶切,通过Cla1+ PacI克隆入前述pWPI-PAC载体.克隆得到的载体组合即为慢病毒反应元件筛选报告载体文库.在此基础上,我们将报告载体文库转染细胞,并进行超声照射.超声照射剂量为10min,100mW/cm2.每天一次,一共照射3天.每次超声照射后,对细胞进行puromycin处理.4天后,收集超声照射存活细胞,提取DNA,PCR扩增含有20N的序列并进行测序鉴定.结果 我们成功设计了一套文库构建方案,初步构建了20N随机序列+miniCMV +Puromycin抗性基因的文库.将该文库转染细胞,超声照射后可以增加转染有对超声反应克隆细胞中抗性基因表达;我们通过获取Puromycin处理后的存活细胞,发现了潜在的对超声反应的调控元件.结论 我们构建的20N随机序列+miniCMV +Puromycin抗性基因文库,可以用于筛选对超声等特定条件有表达调控反应的顺式反应元件;进而为该元件控制基因表达提供依据.
