首页 > 文献资料
-
重组pcDNA3.0-WWOX构建对胆囊癌细胞表达及△Ψ m的影响
目的 体外构建及鉴定PeDNA3.0-WWOX真核表达载体,探讨过表达WWOX对人胆囊癌细胞WWOXmRNA表达、蛋白表达及跨膜电位(△Ψm)的影响.方法 提取人胆囊癌细胞总RNA,RT-PCR反应合成WWOX的cDNA,PCR产物回收纯化.目的基因WWOX和pcDNA3.0载体经限制性内切酶ECOR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切,将双酶切WWOX片段与pcDNA 3.0载体在T4DNA连接酶的作用下进行连接重组.pcDNA 3.0-WWOX重组质粒转化后,提取质粒经双酶切鉴定及测序鉴定.将pcDNA 3.0-WWOX重组质粒转染人胆囊癌GBC-SD细胞,应用RT-PCR、Western Blot检测WWOX基因的表达水平、JC-1染色检测胆囊癌细胞线粒体跨膜电位(△Ψm)变化.结果 成功构建了pcDNA3.0-WWOX重组载体,经测序DNA序列与Gene Bank中WWOX序列一致.成功转染pcDNA3.0-WWOX重组质粒至胆囊癌GBC-SD细胞中.RT-PCR及Western blot结果显示:胆囊癌GBC-SD细胞转染pcDNA3.0-WWOX重组质粒48 h后pcDNA-3.0-WWOX组灰度比值明显高于各对照组(P＜0.05),对照组间mRNA表达量差异无统计学意义(P＞0.05).pcDNA3.0-WWOX组蛋白表达灰度比值均明显高于各对照组(P＜0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).pcDNA3.0-WWOX组细胞线粒体内绿色荧光信号较对照组增高(P＜0.05),而对照组间细胞线粒体内绿色荧光信号差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外成功构建了PcDNA3.0-WWOX重组载体,顺利进行了重组载体的转化和转染实验.靶向PcDNA3.0-WWOX重组载体可有效抑制胆囊癌细胞WWOXmRNA降解,促进其蛋白的表达,同时有效促进细胞的早期凋亡.WWOX可能参与线粒体依赖的凋亡途径调控胆囊癌细胞的生长.
