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非结构蛋白5A-B文献资料
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HCV NS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用
目的:利用原核表达载体pBVIL1,表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A-B小分子,为进一步研究蛋白酶活性提供方法学.方法:将PCR合成的NS5A-B(2 412-2 427aa)基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1,融合表达NS5A-B片段,包涵体形式的表达产物用8 mol/L脲溶解后,采用离子交换和凝胶过滤两步纯化.利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法,于37℃酶催化条件下,分析NS5A-B底物的降解活性.结果:(1)构建了pBVIL1/NS5A-B重组质粒,鉴定证明NS5A-B基因片段正确地插入表达载体上.融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达.分离纯化重组蛋白后浓度可达0.73 g/L.(2)在NS3蛋白酶作用不同时间后,用SDS-PAGE和Western blot证实,底物带可被明显降解,ELISA分析也证明,NS5A-B具有酶底物活性.结论:含有酶切位点的NS5A-B融合蛋白可被NS3丝氨酸蛋白酶有效地降解,可用作为NS3蛋白酶的底物,可替代全长NS5A-B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究.
