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黑素细胞中PINK1的表达及在氧化损伤中的作用
目的 明确正常人黑素细胞PIG1中PINK1的表达,探讨PINK1在黑素细胞氧化损伤中的作用.方法 ①采用逆转录实时定量PCR(RT-qPCR)及免疫印迹法(WB),检测PIG1黑素细胞中PINK1的mRNA及蛋白的表达水平;②不同浓度 H202处理PIG1细胞24h, CCK-8法测定细胞增殖活力,确定H2O2适浓度;③设计并合成3对PINK1干扰片段(siRNA)转染PIG1细胞,采用RT-qPCR法筛选干扰效率高的siRNA;④实验分组:对照组、Mock组、NC组、转染组.细胞转染48 h后,再加入H2O2处理24h,观察各组细胞形态,CCK-8法测定细胞增殖活力.结果 ①在PIG1黑素细胞中检测到PINK1 mRNA及蛋白的表达;②黑素细胞增殖活力呈H2O2浓度依赖性降低,0.6mmol/L H2O2组降低至(49.02 ±2.40)％,接近IC50,故以此浓度作用24h建立氧化损伤模型;③与Mock组相比,PINKl-siR-NA3转染48h干扰效率高(＞90％ );④与对照组相比,PINK1-siRNA3转染组树突回缩及变圆悬浮的细胞明显增多,转染组细胞增殖活力明显降低(P ＜0.01) .结论 本研究首次明确了 PINK1在正常人黑素细胞中的表达,下调PINK1可加重 H202所致的黑素细胞形态学改变及活力降低,表明PINK1对黑素细胞具有一定的保护性作用.
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槲皮素对H2O2诱导的正常人黑素细胞氧化损伤的保护作用
目的 采用过氧化氢(H2O2)诱导细胞氧化应激模型,探讨天然黄酮类化合物槲皮素对正常人黑素细胞的氧化损伤是否具有保护作用.方法 体外培养的PIG1正常人黑素细胞中分别加入不同浓度的H2O2 (0,0.25,0.5,0.75,1,1.25,1.5mmol/L)作用24h,确定氧化损伤佳浓度,建立氧化应激模型.实验分组:正常对照组、H2O2组、槲皮素(10,20,40μmol/L)预处理2h+H2O2组,分别采用光镜、CCK-8、annexin-V/PI双染流式细胞仪、电镜、DCFH-DA检测槲皮素对H2 O2所致黑素细胞氧化损伤后细胞形态学、活力及凋亡、微观结构和细胞内活性氧自由基(ROS)的影响.结果 与空白对照组相比,随着H2O2浓度增加,细胞活力下降,1mmol/L H2O2作用24h后细胞活力下降至(55±9.8)％,接近IC50,确立氧化应激模型(H2O2浓度为1mmol/L,时间为24h).与H2O2组相比,槲皮素组的细胞活力随槲皮素浓度增加而增加(P均＜0.01);10 ～ 40μmol/L槲皮素组细胞凋亡率随槲皮素浓度增加较H2O2组明显下降(P均＜0.01);槲皮素可减轻H2O2作用后黑素细胞形态和微观结构改变;40 μmol/L槲皮素组细胞内ROS水平较H2O2组明显下降(P＜0.01).结论 槲皮素预处理可防止H2O2所致氧化损伤引起的正常人黑素细胞凋亡,降低细胞内ROS,对氧化损伤的黑素细胞有保护作用.
