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丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆及序列比对分析
目的:研究HCV NS5A区基因的结构与功能,为提高干扰素(IFN)治疗HCV感染的有效性提供依据,及为建立以NS5A蛋白做抗原的新一代诊断试剂盒,提高HCV感染检出率作出有益的尝试.方法:以含HCV1b全长cDNA的质粒HCV17为模板,利用巢式PCR扩增出一段长约500bp的cDNA片段,以此基因片段作为目的基因,进行T-A克隆,构建PMD18-T-NS5A.结果:经酶切及测序证实,PMD18-T-NS5A质粒中的插入基因片段为HCV1b NS5A区部分基因,与HCV标准株HCVJ序列进行比对分析,核苷酸和氨基酸序列的同源性均为90%以上,并且该区段包含了干扰素敏感决定区(ISDR).结论:建立HCV NS5A基因片段稳定的无性繁殖系,并进行同源性分析对研究ISDR序列与IFN疗效的关系是非常重要的;通过基因重组表达NS5A蛋白,可用于HCV诊断试剂盒的研究.
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丙型肝炎病毒1b DY株ns5a基因的克隆及其所表达融合蛋白的免疫原性分析
目的:克隆和表达丙型肝炎病毒(HCV)1b型地方株DY株ns5a基因,为进一步研究和应用该基因及其表达产物奠定基础.方法:采用基因重组技术完成实验.设计特异的引物,采用巢式PCR法,从含HCV 1b DY株全长cDNA的质粒HCV17中扩增出目的片段,约480bp;将其插入克隆载体pMD18-Tvector中,再与原核表达载体pET-28a重组;经酶切、PCR及测序鉴定后转化入BL21菌株,在IPTG诱导下进行融合蛋白的表达.采用SDS-PAGE电泳及Western-blot检测NS5A蛋白表达水平.结果:含有HCV1b DY株ns5a基因的重组体构建成功,并得以表达蛋白,并且NS5A蛋白具有与HCV患者阳性血清中的多克隆的结合活性,具有很好的免疫原性.结论:运用原核细胞基因工程技术成功构建和表达了HCV1b DY株ns5a基因,为进一步研究HCVns5a的基因型及探讨该基因编码的NS5A蛋白的性质和生物学活性创造条件.
