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前列腺癌DU145细胞增殖和克隆形成与延伸因子1α基因表达的关系
目的 探讨延伸因子1α(EF-1α)基因表达与前列腺癌细胞株DU145细胞增殖、克隆形成等功能的关系. 方法 DU145细胞株分3组:对照组(未转染siRNA),转染对照组(转染随机siRNA)和实验组(转染EF-1α-siRNA).应用RNA干扰技术特异性调低DU145细胞株EF-1α蛋白质水平,并通过蛋白质印迹法验证.应用体外细胞功能分析技术,比较EF-1α蛋白质水平调低后DU145细胞增殖、克隆形成能力的变化和差异. 结果 应用RNA干扰技术实现了特异性调低前列腺癌细胞株DU145中EF-1α的水平.转染随机siRNA不影响DU145细胞中EF-1α蛋白质水平.调低DU145细胞EF-1α蛋白质水平后,实验组DU145细胞第4～7天增殖率较对照组下降45.9%、53.5%、35.3%和38.1%(P<0.05).实验组DU145细胞形成克隆数较对照组减少67.0%(P<0.01). 结论 调低EF-1α表达水平对前列腺癌细胞增殖、克隆形成等肿瘤相关生物学行为产生负面影响.EF-1α基因在前列腺癌靶向治疗中可能成为适当的靶基因.
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高成脂脂肪干细胞系的分子克隆筛选
目的 探讨并筛选具备高成脂能力的脂肪干细胞系表面标志、可应用于脂肪组织工程的种子细胞,以提高组织工程化脂肪的构建效率.方法 胶原酶消化人脂肪组织,获得脂肪干细胞,培养扩增后成脂诱导,收集诱导成熟的脂肪细胞,天花板贴壁培养得到去分化脂肪细胞.比较去分化脂肪细胞与人脂肪干细胞的增殖能力,成脂分化能力及表面抗原表达的变化.结果 去分化脂肪细胞与脂肪干细胞的形态和增殖能力相似;去分化脂肪细胞的成脂分化能力高于脂肪干细胞;两种细胞表面抗原的表达大致相同,但去分化脂肪细胞的CD54的阳性表达高于脂肪干细胞.结论 CD54的表达可能与去分化脂肪细胞的高成脂分化能力密切相关,可能是高成脂系干细胞的特异性表面抗原标志.
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鸡转录增强因子-1相关基因cDNA片段的克隆及其在发育过程中的表达
目的:克隆转录增强因子-1(transcription enhancer factor-1,TEF-1)相关基因(related TEF-1,RTEF-1),检测鸡发育过程RTEF-1基因的表达及组织分布.方法:从13 d鸡胚骨骼肌mRNAs经RT-PCR方法扩增RTEF-1的编码序列(cDNA),将其克隆到pGEM和pUC载体并进行核苷酸序列分析.采用RT-PCR技术检测鸡胚发育第9天至雏鸡孵出后6周的骨骼肌组织中RTEF-1基因的表达,并测试其在13 d鸡胚和出生后1 d雏鸡的骨骼肌、心肌、脑、肝和胗等5种组织中的存在.结果:克隆序列分析结合GenBank检索表明,所克隆的cDNA片段(900 bp)与cTEF-1A序列仅相差两个碱基.应用RT-PCR技术在鸡胚发育9 d至出生后6周雏鸡的骨骼肌组织均检出了RTEF-1基因的表达;13 d鸡胚和出生后1 d雏鸡的骨骼肌、心肌、脑、肝和胗等5种组织中均有TEF-1相关基因的转录.结论:克隆的cDNA片段属多种组织普遍存在的cTEF-1A.与先前检测的M-CAT结合因子发生规律(在两周前表达)不同,cTEF-1A在鸡胚发育的第9天至出生后6周的骨骼肌组织持续表达.
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大鼠血红素氧化酶1的基因克隆和原核表达
目的:从大鼠脾中克隆出血红素氧化酶1(RHO-1)基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中表达其蛋白.方法:用RT-PCR从大鼠脾总RNA中扩增出RHO-1 cDNA,并将其克隆入pMD18-T载体,经TA克隆测序分析后,将阳性TA克隆RHO-1片段亚克隆入pET28a(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL-21,经限制性内切酶图谱鉴定后,阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析.结果:TA克隆测序分析证实该基因全长870 bp,编码289个氨基酸,所克隆的基因序列与GenBank中登录的RHO-1基因序列完全一致;限制性内切酶图谱结果表明成功构建了RHO-1的原核表达载体;SDS-PAGE结果显示RHO-1基因在大肠杆菌中获得表达.结论:用RT-PCR正确克隆RHO-1基因,构建pET28a(+)/RHO-1表达载体,并成功表达RHO-1融合蛋白.
关键词： 血红素氧化酶(脱环) 克隆分子 原核表达 -
人类睾丸基因TDRG1在不同物种间同源序列的克隆及分析
目的 克隆人类睾丸特异基因TDRG1在不同物种间的同源序列,为研究该基因功能寻找动物模型.方法 以人TDRGI基因全长序列作为查询序列,利用BLASTN 软件检索小鼠、大鼠、黑猩猩和猕猴基因组数据库,查询到的同源序列运用RT-PCR实验验证.免疫组化染色初探TDRG1同源蛋白在不同物种间的表达.结果 生物信息学分析表明小鼠和大鼠基因组中未检索到与TDRG1同源的序列,黑猩猩和猕猴基因组中分别有相似性为98%和90%的同源序列存在.RT-PCR验证了猕猴睾丸中的同源序列,免疫组化结果显示抗人TDRG1单克隆抗体能特异结合猕猴睾丸中的同源蛋白.RT-PCR和免疫组化染色也表明小鼠和大鼠睾丸中无同源序列和同源蛋白表达.结论 TDRG1基因在小鼠和大鼠睾丸中无同源基因表达,而在猕猴和黑猩猩睾丸中有同源基因表达,为今后建立动物模型提供了理论依据.
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人MAGE-3真核表达载体的构建与表达
目的克隆人黑色素瘤特异性抗原MAGE-3基因,构建真核表达载体,建立MAGE-3阳性细胞株,制备肿瘤核酸疫苗.方法用RT-PCR方法扩增MAGE-3 cDNA,以pcDNA3.1+为载体,构建重组表达质粒pcDNA3.1/MAGE-3.重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞,经RT-PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE-3的表达.结果正确构建了pcDNA3.1/MAGE-3重组质粒,并且在转化细胞中检测到了MAGE-3的表达.结论成功构建了pcDNA3.1/MAGE-3真核表达质粒,建立了稳定表达人MAGE-3的鼠B16细胞株.
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大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因的克隆及其真核表达载体的构建
目的克隆大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(CD)基因,构建真核表达载体,本研究拟探索该基因在肿瘤基因治疗中的应用基础.方法根据GenBank数据库提供的CD基因核苷酸序列,设计并合成一对引物,采用PCR方法,从大肠杆菌基因组DNA中扩增出CD基因,并与pcDNA3.1定向连接,构建受控于人巨细胞病毒启动子的重组真核载体pcDNA3.1-CD,并用限制性内切酶、PCR和DNA测序进行鉴定.结果克隆了大肠杆菌CD基因,并构建了真核表达载体,经限制性内切酶酶切、PCR扩增和DNA测序证实了其正确性.结论 pcDNA3.1-CD真核表达载体构建成功.
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FMS样酪氨激酶3受体配基基因的克隆和序列分析
目的获得人FLcDNA膜外序列，以构建表达人FMS样酪氨激酶3受体配基(FL)蛋白的重组体，更深入地探讨FL的生物学功能。方法通过设计和合成引物，提取胎肝细胞总RNA进行逆转录反应，经PCR扩增目的cDNA片段，并将其重组至PUC-18T载体中，测定其DNA序列。结果从胎肝细胞总RNA中扩增得到546bp片段，序列测定证实该片段为包括25个氨基酸残基组成的信号肽的胞外序列。结论 FL胞外区cDNA已被成功地克隆。
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人bit1 cDNA基因的克隆、测序及表达
目的: 克隆并在大肠杆菌中表达人bit1 cDNA基因. 方法: 从新鲜的胎盘组织中提取总RNA,经反转录成单链cDNA, 以此为模板扩增出人bit1 cDNA基因,将该基因克隆入载体pUC19中,测序正确后亚克隆入表达载体pGEX-4T3中进行表达. 结果: 利用所设计的引物扩增出完整的人bit1 cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达,激光薄层扫描显示表达蛋白占总蛋白的40.6%. 结论: 获得了人bit1 cDNA基因及其原核表达产物,对研究人Bit1蛋白的功能具有重要的意义.
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胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA克隆
目的:分离克隆测序胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA.方法:采用mRNA差异展示技术从胃癌GC7901与胃粘膜GES-1细胞株中分离出一差异表达基因片段,对其命名,并进行克隆、测序及GenBank检索;以此片段作探针与细胞株总RNA进行打点杂交.结果:从差示PCR电泳凝胶中分离出大小为416bp的差异表达片段,命名为gcys-18;RNA打点杂交证实gcys-18在GC7901中呈高表达,在GES-1中呈低表达,表明gcys-18是真正差异表达片段;对gcys-18进行了序列分析及GenBank检索,示其为新序列后递交给GenBank,它的GenBank接受号为AF071057.结论:分离并克隆了胃癌高表达基因gcys-18的部分cDNA,此基因可能与胃癌发生发展有关.
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丙型肝炎病毒NS5A基因的克隆及序列比对分析
目的:研究HCV NS5A区基因的结构与功能,为提高干扰素(IFN)治疗HCV感染的有效性提供依据,及为建立以NS5A蛋白做抗原的新一代诊断试剂盒,提高HCV感染检出率作出有益的尝试.方法:以含HCV1b全长cDNA的质粒HCV17为模板,利用巢式PCR扩增出一段长约500bp的cDNA片段,以此基因片段作为目的基因,进行T-A克隆,构建PMD18-T-NS5A.结果:经酶切及测序证实,PMD18-T-NS5A质粒中的插入基因片段为HCV1b NS5A区部分基因,与HCV标准株HCVJ序列进行比对分析,核苷酸和氨基酸序列的同源性均为90%以上,并且该区段包含了干扰素敏感决定区(ISDR).结论:建立HCV NS5A基因片段稳定的无性繁殖系,并进行同源性分析对研究ISDR序列与IFN疗效的关系是非常重要的;通过基因重组表达NS5A蛋白,可用于HCV诊断试剂盒的研究.
