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磁性荧光纳米颗粒标记免疫层析技术检测副溶血性弧菌热稳定直接溶血素的试验研究
目的 通过抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒相结合的免疫层析技术,建立一种快速检测产热稳定直接溶血素(TDH)副溶血性弧菌的方法.方法 构建产TDH副溶血性弧菌基因片段并进行扩增,扩增产物与质粒载体(pET-28a)连接,并在大肠埃希菌中表达,制备抗体.抗体与标记的磁性荧光纳米颗粒偶联后,制成免疫层析检测试纸条.将混有不同浓度标准菌株样品和阴性对照样品分别与荧光纳米颗粒-单抗偶联物和试纸条共同反应5min,紫外光下肉眼观察结果.对试验的敏感性、特异性、重复性进行测试并进行样品模拟试验.结果 重组质粒载体在大肠埃希菌B L21(DE3)可稳定高效地表达分子量为26 kD的可溶形式的目的蛋白,并实现了单克隆抗体与磁性荧光颗粒很好的偶联,所得偶联物与低浓度10 CFU/ml阳性菌株反应,阴性对照菌株无反应.结论 试验制备的产TDH副溶血性弧菌毒力基因表达产物与磁性荧光纳米颗粒有机结合,检测操作过程简单,具有灵敏度高、特异性强、重复性好和检测时间短等特点.
关键词： 副溶血性弧菌 热稳定直接溶血素 荧光纳米颗粒标记技术 免疫层析 检测 -
副溶血性弧菌热稳定直接溶血素基因转录水平差异研究
目的：运用实时荧光定量 PCR 检测24株副溶血性弧菌热稳定直接溶血素（TDH）基因转录水平差异。方法普通 PCR 法检测分离自患者、海产品和环境中的副溶血性弧菌 tdh 基因，tdh 阳性菌株提取细菌总 RNA 后逆转录合成 cDNA，检测无 DNA 污染后定量至同一浓度，采用实时荧光定量 PCR 同时检测 cDNA 产物中 tdh 基因和内标基因16 S rRNA 的 Ct 值，ΔCt 等于 tdh 的 Ct 值减去16 S rRNA 的 Ct 值，以ΔCt 值反应 tdh 相对于内标基因16 S rRNA 的转录水平。结果24株副溶血性弧菌的 tdh Ct 值、内标基因16 S rRNA Ct值和各样本两者之差的ΔCt 值结果范围分别为18.04～25.95、8.30～10.93和8.28～15.34，ΔCt 大值与小值差为7.06，高转录水平菌株为低菌株的133倍（ΔΔCt ＝27.06）。结论副溶血性弧菌 tdh 基因转录水平存在较大差异，该差异性形成的分子机制以及与该菌的致病性的关系有待进一步研究。
关键词： 副溶血性弧菌 热稳定直接溶血素 转录 实时荧光定量 PCR
