实时荧光单引物等温扩增检测阪崎克罗诺杆菌方法的建立

目的 建立实时荧光单引物等温扩增(SPIA)检测阪崎克罗诺杆菌的方法.方法 本文以阪崎克罗诺杆菌OmpA基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,对4株不同来源阪崎克罗诺杆菌和21株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA特异性分析,通过不同浓度梯度阪崎克罗诺杆菌菌悬液灵敏度的检测和添加有阪崎克罗诺杆菌的婴儿配方奶粉样品检出限的确定,评价方法的准确度.结果 除4株阪崎克罗诺杆菌外,其他细菌均未出现特异性荧光扩增曲线,具有良好的特异性.在40 min内,实时荧光SPIA检测阪崎克罗诺杆菌纯培养基因拷贝灵敏度为每反应1 copies,相应活菌数为1.6×10-1 cfu/ml;对婴儿配方奶粉模拟样品中阪崎克罗诺杆菌的检出限是1.5×100 cfu/100 g.结论 本研究建立的方法具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单等优点,适用于实验室快速检测阪崎克罗诺杆菌OmpA基因.

多重聚合酶链式反应技术及其应用

标准的聚合酶链式反应是使用一对引物扩增一个特定的核酸序列,即单一引物对的PCR.但是在具体工作中有时需要同时对多个核酸序列进行扩增分析.显然,单引物对PCR要完成这类工作,需要耗费较多的时间和金钱.1988年,Chamberlain等[1]描述了一种多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, M-PCR).

以单引物同时扩增新疆出血热病毒M和S基因

克里米亚-刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF)的病原是经蜱传播的克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV),曾于1945年在前苏联的克里米亚半岛导致首次病例.该病在中国称新疆出血热(XHF),于1965年首次诊断于南部新疆,后在北疆及新疆以外的地区,如青海、云南等地的人群和动物中查出抗体.由于病毒的生态圈既包括蜱之间的垂直传播又包括蜱与脊椎动物(野生动物、家畜及鸟类)之间的水平传播,CCHFV现已呈世界范围分布.病毒的人-人之间的传播曾引起多次牧场散发和医院内暴发流行.CCHFV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)内罗病毒属(Nairovirus).基因组有小(S)、中(M)、大(L)3个负链RNA片段,分别编码核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)及RNA聚合酶(RNA-dependentpolymerase)[1,2].目前尚未见到M基因研究报道(只是在GenBank中有CCHFV原型株10200的序列).为研究M基因的结构及其编码GP的功能,本文报道一种改进的RT-PCR方法,使用单一引物准确地同时扩增出XHFV近5.4kb的M基因和约1.7kb长的S基因.

兔的单引物PCR指纹分析

RAPD技术在中药材鉴定中的应用进展

随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)技术是1990年由Williams等发展起来的一项DNA分子标记技术.RAPD技术是建立在PCR技术的基础上,用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10 bp)作为引物,对所研究的基因组DNA进行单引物扩增.

核酸等温扩增技术研究进展

核酸扩增技术是生物医学领域病原体确认的常用检测技术.近年新发展起来的核酸等温扩增技术,无论是在实际操作还是仪器要求方面,都比PCR技术更为简单方便,它摆脱了对精良设备的依赖,在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景.在众多等温扩增技术中,环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用,其他一些新发展起来的等温扩增技术,如链替代等温扩增、滚环等温扩增、依赖解旋酶等温扩增、依赖核酸序列等温扩增、单引物等温扩增和核酸快速等温检测放大等技术,也在不断发展与完善之中.为了更好地有选择地开发利用这方面技术,现就这些等温扩增技术的原理、特点及其在疾病检测中的应用进行综述.扩增.整个过程由准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环扩增3个步骤组成.