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可诱导性表达呼吸道合胞病毒蛋白细胞系的快速构建方法研究
目的 研发用以快速构建多种可诱导性表达呼吸道合胞病毒(RSV)蛋白的细胞系创新性的技术路线.方法 将不同的RSV病毒蛋白基因分别连接到含有PiggyBac转座子位点的Cumme诱导表达载体上,与PiggyBac转座酶质粒共转染HEK293细胞,利用嘌呤霉素进行筛选,并用Cumate诱导病毒蛋白表达.结果 流式细胞仪及Westernblot检测结果均表明,加入诱导剂Cumate后,筛选的细胞系中开始表达相应的病毒蛋白,提示细胞系构建成功.结论 利用PiggyBac转座子可以高效率的构建诱导性表达RSV病毒蛋白的细胞系.
关键词： 呼吸道合胞病毒 PiggyBac转座子 诱导性表达 细胞系构建 -
可诱导性表达多种流感病毒HA蛋白稳定细胞系新型构建方法的研究
目的 建立一条创新性的技术路线快速构建可诱导性表达多种甲型流感病毒(IAV)HA蛋白的细胞系.方法 将多种IAV的HA蛋白基因连接到含有PiggyBac转座子位点的Cumate诱导表达系统中,与PiggyBac转座酶质粒共转染HEK293A细胞系,利用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并用Cumate诱导相应病毒蛋白表达. 结果 流式细胞仪检测及Western blot检测结果均表明,加入诱导剂Cumate后,获取的细胞系中绝大部分细胞均开始表达相应的病毒蛋白.结论 利用PiggyBac转座子可以高效率的构建诱导性表达IVA HA蛋白的细胞系.
关键词： 流感病毒 PiggyBac转座子 诱导性表达 细胞系构建 -
稳定过表达CLN3的SY5Y细胞增殖功能加强
目的 建立稳定表达CLN3(ceroid-lipofuscinosis,neuronal 3)和CLN3 1.02 kb缺失突变体基因(CLN3Δex7/8)的稳定细胞系,研究全长CLN3在人神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞中的促增殖作用及7、8号外显子缺失突变体对细胞增殖的影响.方法 利用药物Zeocin筛选构建稳定过表达CLN3全长基因和CLN 3Δex7/8的SH-SY5Y细胞系,用RT-PCR,Real Time PCR和Western印迹检测CLN3全长及截短基因(CLN 3Δex7/8)的表达,并用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖,比较两种细胞系对SH-SY5Y的增殖的影响.结果 成功构建了稳定过表达CLN3全长基因细胞系SH-SY5Y/C和CLN3Δex7/8的细胞系SH-SY5Y/Ct,mRNA水平分别过表达43倍和124倍,蛋白水平分别过表达1.5倍和20倍.过表达CLN3全长基因与空质粒对照组相比,增殖速率明显提高(P=0.044 527),差异有统计学意义,而过表达CLN 3Δex7/8的空质粒对照组相比,增殖速率无差别(P =0.345 329),差异无统计学意义.CLN3Δex7/8对细胞的增殖没有明显促增殖作用.结论 CLN3全长基因对细胞增殖具有明显促进作用,而过表达CLN 3Δex7/8对细胞的增殖没有明显影响,结果提示CLN3基因的7、8号外显子是调控细胞增殖的关键区域.
关键词： SH-SY5Y细胞 CLN3 CLN 3Δex7/8 细胞系构建 增殖 -
宫颈癌细胞辐射敏感性与IER5基因的关系
[目的]通过RNA干扰技术致基因沉默和基因过表达的方法研究IER5基因与宫颈癌SiHa细胞系辐射敏感性的相关性,探讨IER5基因不同表达的细胞系对辐射敏感性的差异.[方法]构建IER5沉默及过表达的真核表达载体,转染细胞并筛选出稳定表达的细胞系,经Western Blot和Real-time PCR鉴定成功.观察IER5基因不同表达的3种细胞系的形态;对细胞系进行4Gy的辐射后使用CCK-8检测细胞生长曲线;对细胞系进行10Gy的辐射后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;对细胞系进行4Gy的辐射后使用流式细胞仪检测不同时间点细胞周期的情况.[结果] IER5基因沉默使SiHa细胞略有增大,照射后的细胞增殖速度加快;而其过表达可使SiHa细胞缩小呈圆形,并且细胞增殖速度有所减慢.IER5沉默导致辐射诱导的SiHa细胞凋亡率降低,过表达可促进辐射诱导的SiHa细胞凋亡,其凋亡在照射后48h为显著.照射后细胞周期的G2-M期阻滞效应随IER5表达含量的降低而升高,IER5基因沉默促进细胞的增殖分裂.[结论]IER5基因与宫颈癌SiHa细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化及对辐射的反应有明显相关性,IER5基因可能可提高宫颈癌细胞对放射的敏感性.
