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H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及分子进化分析
目的克隆H5N1亚型禽流感病毒HA基因并进行分子进化分析.方法应用RT-PCR方法,以2株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了HA全基因cDNA.将HA cDNA基因克隆于pUCm-T载体,并对其进行了测序.结果所克隆的HA基因全长为1 731 bp,共编码568个氨基酸.将该毒株与其它10株H5亚型禽流感病毒HA基因序列核苷酸及氨基酸进行比较,其核苷酸同源性在80.5%～99.2%之间,氨基酸序列同源性在89.4%～98.6%之间.高致病性毒株HA基因裂解位点存在多个碱性氨基酸插入.结论为禽流感基因工程疫苗的研制奠定了基础,同时通过分子进化分析也揭示了各毒株间的亲缘关系.
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甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体的构建及表达
目的 构建含有甲型流感病毒HA基因的核酸疫苗表达载体,转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达.方法 将甲型流感病毒New Caledonia/20/99(H1N1)接种鸡胚后,收获尿囊液,提取流感病毒总RNA,RT-PCR法扩增HA基因.经亚克隆后获得质粒pMD-T/HA,酶切鉴定后测序,将其与质粒pVAX1分别双酶切后连接,构建甲型流感病毒表达载体pVAHA.脂质体法转染COS-7细胞,并检测目的蛋白的表达.结果 扩增出1700 bp片段,与预期的HA基因大小相符,测序结果与GenBank报道一致,酶切鉴定表明甲型流感病毒表达载体pVAHA构建正确,Western blot检测证明了流感病毒HA蛋白的表达.结论 已成功构建了甲型流感病毒HA基因核酸疫苗表达载体pVAHA .
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黑龙江省2014-2015年H3N2流感病毒HA基因特性分析
目的 了解黑龙江省2014-2015年流感病毒优势株H3N2亚型HA基因变异特征.方法 选取2014-2015年流感流行季节16株H3N2代表株进行HA基因扩增并测序,用DNAStar软件和MEGA 6软件分析序列并绘制基因进化树.结果 16株H3N2流感毒株经序列拼接后HA基因全长均为1701bp,编码566个氨基酸,同WHO推荐的北半球A/Switzerland/9715293/2013和A/Hong Kong/4801/2014 H3N2流感病毒疫苗株高度同源;黑龙江省从2015年11月开始H3N2亚型流感毒株逐渐由3C.3a向3C.2a支系转变,这与WHO推荐的2015-2016年流感病毒疫苗株A/Switzer-land/9715293/2013 (3C.3a)相比存在差别;16株H3N2代表株在抗原决定簇A区第142、第144位和B区第159、第160位上氨基酸发生改变.结论 黑龙江省H3N2亚型流感病毒抗原性和HA1基因发生了一定的变异.
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甲型流感病毒的分离及HA基因的序列分析
目的 分离临床流感患者的甲型流感病毒及对其HA基因进行序列测定,分析HA基因是否存在变异.方法 采用流感病毒的增殖、血液凝集实验、RT-PCR、蓝自筛选、酶切、DNA序列测定方法,获得甲型流感病毒HA基因的序列,进行序列分析.结果 甲型流感病毒HA基因RT-PCR的电泳条带为1700bp;酶切后电泳条带为1700bp和3000bp;并获得甲型流感病毒HA基因的序列.结论 从临床流感患者分离的流感病毒H1N1/H3N2其HA序列与以往的流感病毒序列无明显差异.
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2015-2017年盐城市甲型H3N2流感病毒HA1、NA基因分子特征
目的 从分子流行病学角度对盐城市2015-2017年流行的甲型H3N2流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA) 基因的分子特征进行研究.方法 收集盐城市2015-2017年流感监测哨点医院以及流感爆发点采集的3 891例流感样病例标本进行核酸检测和病毒分离,从中筛选出20株经血凝抑制试验(hemagglutination inhibition,HI)验证为甲型H3N2亚型的毒株,采用反转录聚合酶链式反应方法扩增其HA1和NA基因并进行测序.结果 2015-2017年流行的20株甲型H3N2毒株HA1和NA基因各自分支的聚类关系基本一致.盐城市A/Jiangsu-YC/1474/2015、A/Jiangsu-YC/1725/2015两株分离株与疫苗株A/Switzerland/9715293/2013和A/Hongkong/4801/2014的进化距离较近,而其余18株分离株与国内部分省市相近年份毒株亲缘关系相近,并与疫苗株A/Switzerland/9715293/2013和A/Hongkong/4801/2014进化距离较远 该20株毒株HAl基因编码区抗原表位、受体结合位点和糖基化位点均发生了一定程度变异.从基因变异角度进行分析,疫苗株A/Switzerland/9715293/2013对盐城地区流感流行的保护效果要弱于疫苗株A/Hongkong/4801/2014.结论 2015-2017年盐城市流行的甲型H3N2毒株HAl和NA基因已逐渐发生变异,可能导致流感病毒发生实质性的抗原性漂移,降低与流感疫苗株的匹配度,减弱流感疫苗的保护作用.
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表达猪源流感病毒HA基因重组伪狂犬病毒的构建
目的 获得共表达H1N1和H3N2亚型猪源流感病毒(SIV) HA 基因的重组伪狂犬病毒(PRV).方法 克隆H1N1以及H3N2亚型SIV的HA基因,将HA基因与PUC-TK转移载体进行酶切、连接来构建pUC-P-H1A-H3A重组表达质粒,用脂质体将其转染已感染PRV亲本病毒的Vero细胞,使其在Vero细胞内与PRV基因组发生同源重组.运用RT-PCR、间接免疫荧光等方法检测外源基因重组情况及其在Vero细胞内的表达,并通过Western-blot对表达产物进行免疫原性鉴定.结果 实验结果显示,外源基因HA已重组入PRV基因组,并在Vero细胞中有效表达,且所表达蛋白具有免疫原性.结论 HA基因重组PRV的构建成功为SIV HA基因重组PRV活载体疫苗的研究奠定了初步基础.
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输入性甲型H1N1流感病毒HA基因进化特征
目的 分析输入性甲型H1N1流感病毒的HA基因进化特征,及早发现变异株.方法 选取广东口岸入境人群中检出的53份输入性甲型H1N1流感阳性样本,扩增其病毒HA基因并测序,与2009年甲型H1N1流感代表株A/Cali-fomia/04/2009/H1 N1比较,对甲型H1N1流感病毒的HA基因进行系统进化分析.结果 HA基因进化树可分为4个分支,2009年、2010年病毒共同位于第Ⅰ、Ⅱ分支,2011年病毒位于第Ⅲ、Ⅳ分支,其中第Ⅰ、Ⅱ分支与Ⅲ、Ⅳ分支距离较远.HA核苷酸序列有11个碱基位点变异较为显著.HA蛋白5个抗原决定簇位点S202T、A203T、D204N、S220T和R222K发生变异,受体结合位点、糖基化位点氨基酸较保守.通过三维构象看出,大部分氨基酸变异位于HA1分子表面.结论 甲型H1N1流感病毒HA基因已发生一定程度的变异.随着突变的不断积累,病毒极可能会通过改变其抗原性,从而引起新的流行.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 HA基因 进化 -
2005年-2009年大连市季节性甲型H1N1流感病毒HA基因序列分析
目的:分析大连市2005年-2009年流感病毒H1N1亚型血凝素抗原性及其基因变异情况,为流感防治提供技术支持.方法:采集流感样病例的鼻咽拭子标本,用MDCK细胞进行流感病毒的病原分离,采用红细胞凝集实验测定病毒的滴度,用血凝抑制试验和RT-PCR进行流感病毒型别鉴定,通过RT-PCR扩增血凝素HA片段的基因,电泳、纯化后进行基因序列测定,利用生物信息学进行序列分析.结果:2005年-2009年共分离到季节性甲型H1N1流感病毒39株,其中28株进行了测序.与当年的疫苗株相比,2005年、2006年、2007年和2008年分离株的HA1区分别发生了11个、9个、15、15个突变.结论:在近几个年度的流行季节中,该地区有H1N1亚型流感的存在.该地H1N1流感病毒分离株有多处氨基酸发生替换,氨基酸的替换导致毒株的抗原性发生了漂移.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 HA基因 基因序列 -
湖州市甲型H1N1流感病毒株的HA基因分析
目的:研究2010年湖州市甲型H1N1流感分离株(A/Huzhou/2010(H1N1))的HA基因特征.方法:采用MD-CK细胞对患者咽拭子和漱口液标本进行病毒分离,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒HA基因并进行序列测定,用DNAstar和MegAlign等软件分析处理.结果:湖州市2010年甲型H1N1分离株的HA基因为1739个核苷酸,与湖州市2009年的分离株及WH02010/2011推荐的甲型H1N1疫苗株相比,没有核苷酸的插入与丢失,氨基酸同源性分别为99.0%和98.9%.进化树分析显示,本次分离株与湖州市2009年的分离株及WH02010/2011推荐的疫苗株非常相似.结论:甲型H1N1流感分离株的分子生物学特征及变异特征分析,对制定科学有效的防控策略具有重要意义.
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一例混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒HA1和NA基因特异性分析
目的 了解一例新甲型H1N1和季节性H3N2亚型流感混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒HAl和NA基因的变异情况.方法 分离病毒毒株,提取核酸经反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增HA1和NA基因,获得测序结果与WHO推荐2009年-2014年各年的疫苗株和疫苗相似毒株同源比对,使用生物信息软件绘制种系发生树.结果 HA1基因进化树分析表明该毒株与2013年各地区筛选毒株集中于同一分支,与2013年-2014年疫苗株比对共有8个位点的氨基酸发生变化.NA基因与2013年-2014年推荐疫苗相似株同源性比对有2个位点氨基酸发生变化,未出现耐药位点的变异.结论 本次研究所分离毒株与2013年-2014年疫苗株和疫苗相似株比对其HA1和NA基因都有变异,并未发现耐药位点的变异.
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宜昌市连续多起B型流感疫情病毒基因特性分析
目的 分析2017年宜昌市流感疫情中BY流感毒株的HA和NA基因特性,了解其与WHO推荐的系参考株、疫苗株和当地代表株的匹配情况.方法 对流感疫情病例标本中分离得到的7株BY型流感毒株的HA和NA进行扩增和序列测定,通过Mega 5.0软件对测序产物进行分析.结果 7例疫情毒株均为BY系的HA蛋白的3分枝,相互间HA基因的核苷酸和氨基酸同源性达98.9％和99.3％;与WHO疫苗株B/PHUKET/3073/2013比较,进化距离接近,没有发现氨基酸序列的丢失与插入,HA基因有2个氨基酸位点发生变化,NA基因有11个氨基酸位点发生变化.结论 引起流感疫情的毒株目前变异不明显,与WHO疫苗株匹配,应加强重点人群的疫苗接种.开展连续流感分子生物学监测,及时分析病毒基因特性,对流感的防控有重要意义.
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禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用
根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank: DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.
关键词： H5N1亚型禽流感病毒 HA基因 定点突变 表达 -
禽流感病毒HA部分基因的克隆及其表达
禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是正粘病毒科流感病毒属的成员.AIV核酸为单链线状分段RNA,病毒表面囊膜上镶嵌着两种重要纤突,即血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA).HA和NA与病毒的毒力、传染性密切相关.其中ha基因是重要的免疫原性基因,它刺激机体所产生的抗体可中和病毒、抵抗感染,同时,由于AIV基因组中ha基因极易发生变异,故对ha基因的研究已成为目前研究AIV的热点.我们已成功克隆了禽流感ha基因的部分片断,并对其分子特性作了初步研究,现报告如下:
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广州市A型流感病毒血凝素基因的遗传变异研究
[目的]了解2006-2007年广州地区流感的病原学分布,掌握H1N1亚型流感病毒血凝素基因(HA)的遗传和进化特征.[方法]选取2006-2007年广州市19个流感监测点的流感病毒代表株共45株,应用病原学、血清学和分子生物学方法对病毒的型别进行了鉴定;选取24株H1N1亚型流感病毒进行全长HA基因的扩增、克隆与分子进化分析.[结果]A型流感病毒H1N1和B型流感病毒交替成为广州地区2006年流感的优势流行株:2006-2007年广州地区H1N1亚型流感病毒流行株在HA蛋白的抗原区、受体结合位点和潜在糖基化位点均发生了点突变;遗传进化分析结果表明,24株H1N1亚型毒株间基因同源性的平均值为98.4%;与WHO推荐的疫苗株(New Caledonia/20/1999和Solomon Islands/3/2006)相比,同源性高达96.6%和97.8%.[结论]2006年,广州地区流感的病原体为H1N1亚型流感病毒和B型流感病毒;2006-2007年广州市H1N1亚型流感病毒HA基因发生了一定程度的变异,有必要对毒株的变异加强监测;WHO推荐的2006-2007年H1N1亚型流感病毒疫苗株适用于我国人群的免疫预防.
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重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析
目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析，与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对，研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同，选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序，同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果，经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析，并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下，各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间，氨基酸差异在0～3．1％之间；与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间，氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多，但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征；2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点，2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用，但随着时间推移，部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移，需继续对其监测。
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2016年盐城市1例人感染H7N9禽流感病毒HA 、NA基因变异分析
目的 了解盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因分子进化特征,为更好预防和治疗人感染禽流感H7N9病例提供科学依据.方法 通过荧光定量PCR方法对标本进行流感病毒分型检测,对禽流感H7N9病毒荧光PCR阳性的标本,采用一步法RT-PCR方法对H7 N9病毒HA基因和NA基因全长编码区进行扩增,扩增产物经纯化测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸及氨基酸序列比对及基因种系进化特征分析.结果 盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因有着独特的进化方式,A/JSYC/1/2016 (H7N9)病毒株HA裂解位点附近氨基酸序列为PEIPKGR/GL,属于低致病性禽流感病毒.HA基因编码蛋白受体结合位点出现了G186V、Q226L氨基酸位点的变化,增强了病毒对人的感染能力,NA基因编码蛋白主要可能的神经氨酸酶抑制剂耐药位点未发生E120G、R153K、H276Y、R294K的变异.结论 2016年盐城市禽流感H7N9病毒株HA基因和NA基因处于基因点突变的抗原漂移变化中,某些变异位点具备了感染人的某些分子特征.
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B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株HA基因重组3型腺病毒的构建
目的:构建包含有B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株血凝素(HA)基因的重组3型腺病毒.方法:用PCR方法扩增得到HA基因, 酶切后克隆至3型腺病毒穿梭质粒pSK-CMV, 构建重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 然后在大肠杆菌BJ5183内进行经 Not I和 Eco R V线性化的pSK-CMV-HA和经 Rsr Ⅱ线性化的骨架质粒pBRAdV3△E3的同源重组, AsiS I酶切线性化重组腺病毒质粒pBRAdV3△E3-HA后脂质体法转染HEp-2细胞, 进行病毒包装和增殖后得到重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 并且通过病变观察、扫描电镜、 RT-PCR、免疫细胞化学方法对基因组的包装和HA基因的表达进行检测.结果:将HA基因克隆入pSK-CMV获得重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 线性化的pSK-CMV-HA与pBRAdV3△E3同源重组后获得pBRAdV3△E3-HA, 线性化的pBRAdV3△E3-HA转染HEp-2细胞观察到细胞病变和HA基因的表达.结论:成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 为B型流感病毒-3型腺病毒二联活苗的研究提供了依据.
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我国2006-2007年人禽流感病毒H5N1亚型HA特征分析
目的 分析H5N1禽流感病毒HA基因核酸和蛋白变异、分子流行病特征及病毒溯源,为制备相应病毒疫苗提供信息.方法 获取GenBank上2006-2008年我国及邻国人及禽类H5N1病毒HA核酸序列,Clust-alX1.83和MEGA4.0对HA核酸和蛋白关键位点氨基酸残基分析,比较同源性,构建HA核苷酸遗传进化树.结果 本文人源样本基因变异率为4.1%-4.6%,高于该病毒平均变异率;我国人和家禽样本高度相似,2007年越南和马来西亚与中国样本核苷酸和氨基酸高度相似.结论 病毒适应人类这个新宿主时为避免强大的免疫压力进行了适应性变异,可能更易于感染人类,但病毒抗原性尚未改变;毒株在邻近国家之间存在扩散现象.
关键词： 人禽流感H5N1病毒 HA基因 特征 感染 -
东南亚禽流感病毒H5N1的HA基因特征分析
目的 分析东南亚禽流感病毒HA基因和蛋白序列的特点,比较与我国人禽流感病毒的异同,为人禽流感防控工作提供参考.方法 从GenBank获得东南亚和我国H5N1禽流感病毒HA核酸序列,ClustalX1.83和MEGA4.0对HA核酸和蛋白分析,构建遗传进化树.结果 东南亚各国HSN1病毒受体位点氨基酸为QSG;越南、泰国、柬埔寨HA蛋白关键位点氨基酸基本没有变化;印尼多个样本发生改变,进化树中聚于一个分支内;中国人与老挝、马来西亚样本关键位点氨基酸相同,进化树中处于同一分支中.结论 越南、柬埔寨和泰国HSN1病毒流行株HA蛋白未影响病毒毒力,印尼为一独立的病毒体系,中国与老挝和马来西亚样本来源于同一毒株,中国、老挝和马来西亚之间存在着病毒扩散现象.
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安徽省2009年～2011年甲型H1N1流感病毒HA基因特性监测
目的 了解安徽省2009～ 2011年安徽省甲型H1N1流感病毒HA的基因特性.方法 提取病毒RNA,经RT-PCR扩增HA基因后测序,进行同源性分析和基因进化分析.结果 传入阶段HA基因同源性为99.4％～99.6％,蔓延阶段为99.4％ ～ 99.7％,稳定阶段为98.8％ ～99.5％,再现阶段为98.8％ ～99.1％,说明甲型H1N1流感病毒HA基因在研究两年期间保持较高的稳定性.结论 2011年甲型H1N1流感毒株HA基因较2009年流行毒株存在一定程度的进化,但基本保持遗传的稳定性.
