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云南省狂犬病病毒糖蛋白全编码区序列特征研究
目的 测定云南省狂犬病病毒糖蛋白全编码区基因序列,阐明它们的分子生物学特征.方法 用直接免疫荧光法进行病毒抗原检测,对阳性标本提取病毒RNA,用逆转录聚合酶链式反应对病毒糖蛋白基因进行全序扩增,并对目的基因核苷酸和氨基酸进行同源性和进化树分析以及氨基酸位点分析.结果 在云南省获得18株狂犬病病毒糖蛋白全编码区基因序列,它们的核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性分别为98.2％ ～99.9％和97.3％ ～99.8％,与国内外参考株核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分别为85.7％ ～ 99.9％和93.1％ ～99.8％.进化分析表明,云南流行株分别与我国南方及东南亚流行株亲缘关系较近,但云南株间进化关系较为复杂,可分为六个进化亚群.它们的主要抗原性、致病性、毒力及糖基化等功能位点均未发生明显改变.结论 云南狂犬病病毒流行株具有多样性特点,与省内外、境内外及省内不同地区间犬类流动并传播该病毒相关.云南株狂犬病病毒糖蛋白重要功能位点未发生变异,仍然保持其特有的抗原性和毒力等特征.
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2012-2015年云南省狂犬病病毒糖蛋白基因进化特征分析
目的 了解云南省2012-2015年35株狂犬病病毒(RABV)糖蛋白(G)基因的进化特征及流行病学特点.方法在云南省狂犬病流行区采集可疑犬脑组织以及狂犬病患者脑组织和唾液标本,用直接免疫荧光法进行病毒抗原检测,阳性标本提取病毒核酸,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增RABV的G基因序列,用MEGA 5.0软件邻接法(NJ)进行系统进化树分析.结果 经RT-PCR和序列测定获得2012-2015年云南省35株RABV的G基因序列,并与2006-2011年获得的云南省11株RABV及邻省和东南亚地区的15株RABV的G基因序列进行系统进化分析.结果 表明,云南省46株RABV中,除2006年的Tc06株属于China-Ⅵ进化群外,其他45株均属于China-Ⅰ进化群.云南省China-Ⅰ进化群流行株在2006-2015年间每年均有分布,其中,2006-2011年10株,2012-2015年35株,分布于云南省10个州(市)并与来自四川、贵州和湖南省的China-Ⅰ进化群病毒株的进化关系为接近.China-Ⅵ(Tc06)则与缅甸、老挝和越南的东南亚进化群病毒株亲缘关系近.结论2012-2015年,RABV China-Ⅰ进化群在云南省狂犬病流行区广泛分布,属云南省主要进化群并具较强的传播速率,期间云南省未再发现China-Ⅱ、China-Ⅲ和China-Ⅵ等进化群病毒株的流行.
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狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白基因的克隆和重组腺病毒的构建
克隆了狂犬病毒CVS-N2c毒株糖蛋白(GP)基因,并进行了GP全基因序列测定和对比分析.结果显示CVS-N2c GP基因编码区长1575bp,编码524个氨基酸,与国内外发表的狂犬病毒疫苗株3aG株、ERA株、和HEP-Flury株GP基因的核酸序列同源性分别为89.0%,89.3%,94.5%,而推导的氨基酸序列同源性分别为87.6%、88.4%、和91.2%.在此基础上,用pAdEasy载体系统构建了表达GP基因的重组腺病毒.电镜下确定重组病毒颗粒的直径约70nm,Western blot 显示重组病毒表达的GP 蛋白可被兔抗狂犬病毒血清识别,表达的GP 蛋白分子量约为66kD,与天然的狂犬病毒GP的分子量相符.该表达CVS-N2c毒株GP基因的重组腺病毒是筛选有效狂犬病毒基因工程疫苗的基础.
关键词： 狂犬病毒CVS-N2c毒株 糖蛋白基因 克隆 重组病毒 -
贵州省狂犬病病毒流行毒株与疫苗毒株糖蛋白基因差异研究
目的 分析贵州省狂犬病病毒流行毒株与疫苗毒株的糖蛋白基因(G基因)差异,为狂犬病疫苗研制及有效防控措施的制定提供科学依据.方法 以RT-PCR扩增贵州省近几年人和犬狂犬病病毒阳性脑组织标本G基因序列,对扩增产物进行序列测定后采用生物信息学软件对序列与疫苗株G基因序列进行比较分析.结果 贵州省狂犬病病毒阳性标本经RT-PCR扩增、测序与拼接后得到8株狂犬病病毒G基因全长序列,与我国常用狂犬病疫苗毒株在核苷酸和推导的氨基酸水平上的同源性分别为82.0％ ～94.1％和87.6％ ～ 97.5％,与人用疫苗株中的CTN株G基因核苷酸和氨基酸序列同源性高(分别为87.0％ ～ 94.1％和93.7.％～97.5％),而在兽用疫苗株中与Flury株的核苷酸和氨基酸同源性高(分别为83.9％ ～ 84.6％和91.1％ ～ 93.0％).在所测定序列中以来自贵州省2005年的GZ09与人用疫苗毒株CTN和动物用疫苗株Flury株G同源性高,而以2010年的GZ30与人用疫苗毒株CTN和动物用疫苗株Flury株G基因同源性低.系统进化树分析显示,本次所测定的序列和9株疫苗株与狂犬病病毒基因1～7型中的基因1型代表毒株聚类在同一分支,与疫苗毒株中的CTN亲缘进化关系近,而与其他疫苗株相对较远,所测定序列中以2005年的GZ09与CTN疫苗株同源性近,而其他序列与CTN毒株的亲缘进化关系相对较远.结论 本研究从狂犬病病毒G基因水平证明贵州省狂犬病病毒流行毒株与常用的疫苗株同属狂犬病病毒基因1型,与人用疫苗株中的CTN毒株及兽用疫苗株中的Flury株差异小,且随着时间的推移贵州省狂犬病病毒流行毒株与疫苗毒株G基因的差异越来越大,该研究结果将为狂犬病疫苗研制及有效防控措施的制定提供科学依据.
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贵州及周边省市狂犬病病毒的分群和进化研究
目的 全面掌握贵州及周边省市狂犬病病毒(RABV)的遗传进化特征和分群特点,了解狂犬病疫苗株与流行株的分子遗传差异,为贵州狂犬病疫情的预防和控制提供指导依据.方法 搜索GenBank数据库中贵州及周边5个省市具有明确时间、地区及宿主信息的流行毒株,对其糖蛋白基因(G)全序列进行汇总,并结合本实验室获得的贵州毒株和国内现役疫苗株G序列,利用MEGA和BEAST软件分别进行系统进化和时间进化分析.结果 贵州及周边省市79株RABV均属于基因1型,9个类群的RABV流行株具有明显的地域特征,11株疫苗株分化为2个类群;RABV流行株与疫苗株G基因核苷酸和氨基酸同源性分别为0.827～0.999和0.713～0.998;贵州及周边省市RABV流行毒株的近共同祖先(TMRCA)可追溯至150年前.结论 贵州及周边省市流行的RABV优势毒株群仍属于基因1型,但毒株经过多年流行已经出现了分化,有必要对流行毒株与疫苗株的遗传变异一致性进行深入研究.
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贵州省狂犬病病毒糖蛋白基因序列特征分析
目的 分析贵州省狂犬病病毒的糖蛋白基因(G基因)序列特征,为狂犬病的有效预防和控制提供科学依据.方法 以RT- PCR扩增贵州省近年来不同地区的人和犬狂犬病病毒阳性脑组织标本狂犬病病毒G基因序列,对扩增产物测序后采用生物信息学软件进行序列分析.结果 贵州省狂犬病毒阳性标本经RT-PCR扩增、测序与拼接后得到8份狂犬病病毒阳性样本的G基因序列.同源性分析显示.8份狂犬病病毒阳性样本的G基因序列在核苷酸及氩基酸水平上彼此的同源性分别为87.4％～99.9％和83.3.％～100％,与狂犬病毒基因1型病毒株G基因的核苷酸和氨基酸序列同源性高(分别为86.5％～87.O％和83.3％～100％).进化树分析显示,贵州省狂犬病病毒G基因的亲缘进化关系较近,且与狂犬病毒基因1～7型中的基因1型代表毒株的亲缘进化关系近；除GZ01和GZ09外,其余狂犬病毒G基因与国内湖北、湖南、安徽、广西、江苏和上海毒株相距较近.除GZ09与国外的马来西亚和泰国代表毒株亲缘进化关系近外,其与毒株与印度尼西亚毒株亲缘进化关系近.结论 本研究从狂犬病病毒G基因水平证明贵州省狂犬病毒株属于基因l型,揭示了我省贵州省狂犬病毒与国内外已报道毒株的亲缘进化关系,该研究结果将为贵州省狂犬病的有效预防和控制提供科学依据.
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广西12株狂犬病野毒株的g基因序列测定与分析
对广西12株狂犬病病毒株g基因全序列进行测序分析,结果显示:广西毒株属于Ⅰ型,可分为3个群,即Ⅰ群、Ⅱ群和Ⅲ群.GX01、GX08、GX09、GX014、GX091、GX195、GX260、GXLA 8株为Ⅰ群,GX219、GX074、GXBM 3株为Ⅱ群,GXN119株为Ⅲ群.Ⅰ群的广西毒株g基因核苷酸的同源性为97.6%～99.9%,氨基酸同源性在97.7%～100%之间;Ⅱ群的核苷酸的同源性为98.2%～99.0%,氨基酸的同源性在98.5%～99.2%之间.糖蛋白在主要的抗原位点GⅠ、GⅡ区以及与中和抗原有关的36、263、367位氨基酸没有变异,GⅢ区上只有Ⅱ群在332位缬氨酸变异为异亮氨酸,G蛋白上的氨基酸主要在-2、-5、-13、-14、-15、-16、90、96、132、140、156、168、170、204、241、249、253、264、289、332、382、427、436、445、463、474位共26个氨基酸发生了变异,这些氨基酸的变异具有群的特异性.
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北京市1株人狂犬病病毒分离鉴定及其分子特征
目的 研究北京市一株人狂犬病病毒的N、G基因的分子特征,比较与全国流行株以及疫苗株之间的差异.方法 以直接免疫荧光技术检测病人脑组织,昆明乳鼠颅内接种法分离病毒株.以RT-PCR方法扩增病毒的核蛋白及糖蛋白基因,克隆测序后进行遗传学分析.结果 直接免疫荧光检测到病人脑组织中的病毒颗粒,用乳鼠颅内接种法分离到了毒株,命名为Beijing(H)株.遗传分析表明Beijing(H)株与目前我国的主要流行株N基因和G基因的核苷酸序列同源性分别是97.6%～99.1%和97.5%～99.7%,推导的氨基酸序列同源性分别是97.6%～99.2%和97.7%～99.8%. 结论 Beijing(H)株为基因1型狂犬病毒,属于我国目前的流行株,其与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异.
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云南省2014年狂犬病病毒G基因序列测定与分析
目的 测定2014年云南省狂犬病病毒(RABV)的G基因序列,阐明它们的分子生物学特征.方法 用RT-PCR法对RABV的G基因进行全序扩增,并对它们核苷酸序列和推导氨基酸序列进行同源性和进化树分析以及氨基酸位点分析.结果 经序列测定,共获得16株RABV的G基因全序列.进化分析表明,本次云南RABV均为基因Ⅰ型,与四川、广西及既往云南流行株亲缘关系较近,与东南亚流行株也具有较近的亲缘关系.云南株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.4％～ 100.0％和99.2％～ 100.0％,它们与参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别86.1％～99.8％和92.9％～ 99.8％.云南16株RABV的主要抗原性、嗜神经性、毒力及糖基化等功能位点均未发生明显改变,但信号肽氨基酸序列与参考株间差异较多.结论 2014年云南RABV间无明显差异,均属于我国主要流行的基因Ⅰ型中的中国Ⅰ进化群.云南株RABV的G蛋白重要功能位点未发生变异,仍然保持其特有的抗原性和致病性等特征.
