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KI和WU多瘤病毒的发现及研究进展
1 KIPyV和WUPyV的发现2007年,瑞典斯德哥尔摩卡罗林斯卡学院的科学家Allander等[1]运用大规模分子筛技术从637份小儿下呼吸道感染分泌物和192份粪便中检测出一种新的人类多瘤病毒,并以发现者单位(Karolinska Institutet)命名为“KI多瘤病毒(KI polyomaviruses,KIPyV)”.同年5月,美国华盛顿大学医学院的Gaynor和澳大利亚皇家儿童医院的Nissen等科学家利用分子病毒筛查法从一名患有肺炎的3岁澳大利亚儿童的下呼吸道分泌物中检测到一种新病毒.在完成了该病毒的全基因组测序后,鉴定为另一种新的人类多瘤病毒,并以发现者单位(Washington University)命名为“WU多瘤病毒(WUDolvomaviruses,WUPyV)”.
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多瘤病毒基因载量与出血性膀胱炎发生相关性的研究
目的 研究多瘤病毒的基因载量与异基因造血干细胞移植出血性膀胱炎发生的关系,预防移植后出血性膀胱炎的发生.方法 收集40例健康人和40例异基因造血干细胞移植及20例合并出血性膀胱炎患者的血液和尿液,合成多瘤病毒BKV、JCV和SV40基因引物,应用传统的PCR和EvaGreen染料荧光定量PCR法,分别检测血液和尿液多瘤病毒BKV、JCV和SV40 DNA.结果 40例健康人和40例异基因造血干细胞移植患者血液中BKV、JCV和SV40基因均为阴性;尿液中正常健康人BKV基因的检出率为15%(6/40),JCV基因的检出率为10%(4/40).异基因造血干细胞移植患者BKV检出率为100%(40/40),JCV基因的检出率为12%(5/40),SV40基因均为阴性.20例出血性膀胱炎患者尿液中BKV基因载量均高于正常人和无出血性膀胱炎的异基因造血干细胞移植患者.结论 正常健康人的泌尿系潜伏存在病毒BKV和JCV基因,异基因造血干细胞移植患者出血性膀胱炎的发生与BKV多瘤病毒DNA的载量有关.
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多瘤病毒基因载量与免疫抑制剂剂量相关性的研究
目的 研究异基因干细胞移植免疫抑制剂的剂量与多瘤病毒载量的关系,预防移植后出血性膀胱炎的发生.方法 收集122例干细胞移植患者的血液和同期尿液及1例移植后连续8个月外周血和同期尿液,提取尿液DNA,合成多瘤病毒BKV基因引物探针,荧光定量PCR法检测病毒基因载量和荧光偏振免疫法测定血液环胞素A浓度,动态观察分析二者之间的关系.结果当血液环胞素A浓度高于86～105 ng/ml,尿液BKV-DNA病毒检测阳性,尿液BKV-DNA病毒载量随着血液环胞素A浓度而改变,二者呈线性关系.结论 当机体处于免疫抑制状态时BKV病毒-DNA的载量与使用免疫抑制剂的剂量有关,增加了移植后诱发出血性膀胱炎的危险性.
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实时荧光定量PCR检测儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒
目的 建立并应用检测儿童下呼吸道感染WU多瘤病毒(WU polyomavirus)的实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法.方法 选择WU多瘤病毒的VP2基因作为检测的目标基因,设计FQ-PCR引物和检测探针,以重组质粒为标准品建立标准曲线,并对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评价；应用该方法对温州医学院附属温岭医院收集的临床下呼吸道感染患儿的痰液、咽拭子846份及血清标本846份进行定量检测.结果 本研究建立FQ-PCR检测方法,质粒标准曲线的方差系数为0.998,灵敏度可达到50拷贝；应用该方法检测700份痰液标本,检测到7例阳性标本,146份咽试子标本中未检测到阳性标本,总阳性率为1.00％ (7/700),846份血清标本未检测到阳性标本.结论 本研究建立的FQ-PCR方法可以特异、快速、灵敏地对儿童下呼吸道感染的WU多瘤病毒进行定量检测；痰液标本较咽拭子或血清标本更适用于WU多瘤病毒感染的核酸检测.
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多重实时荧光定量PCR技术检测儿童呼吸道新发病毒方法的建立与应用
目的 建立儿童新发呼吸道病毒的多重实时荧光定量PCR检测方法,并利用该方法进行临床标本的检测.方法 根据人类偏肺病毒、冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、人博卡病毒、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒的保守区域设计并合成引物和探针,确定引物和探针的特异性,优化引物和探针的组合浓度,通过检测具有类似临床症状的其他病原体的标本评价该多重荧光定量PCR方法的特异性,构建质粒标准品用于分析检测该方法的灵敏度和重复性；并对2009至2012年湖州市妇幼保健院及湖州市中心医院收集的322例呼吸道感染患儿的痰液标本进行检测分析.结果 成功建立了这6种新发呼吸道病毒的多重荧光定量PCR检测方法,能够同时或分别对其进行检测.体系中筛选的引物和探针具有很好的特异性,并优化出适合的引物探针组合浓度,灵敏度分析低检测限为10拷贝数/μl,重复性分析中批内变异系数(CV)为1.2％ ～ 3.4％,批间CV为0.08％～0.85％,均小于5％.322份临床标本中,人类偏肺病毒阳性17份,阳性率5.28％,人博卡病毒9份,阳性率2.80％,未检到冠状病毒HKU1、冠状病毒NL63、KI多瘤病毒和WU多瘤病毒.结论 多重荧光定量PCR方法具有简单快速,灵敏性和特异度高等特点,并且能实现多种新发病毒同时并行检测,可为儿童呼吸道新发病毒感染的临床诊治提供技术支持.
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WU多瘤病毒在急性呼吸道感染儿童中的检出及初步临床研究
目的 了解WU多瘤病毒(WU polyomaviros,WUPyV)在小儿呼吸道感染中的检出情况及感染患儿的临床特点.方法 应用PCR技术,对2008年7月至2009年6月广东省汕头大学医学院第二附属医院儿科急性呼吸道感染住院患儿的呼吸道鼻咽抽取液及健康体检儿童呼吸道鼻咽抽取液进行WUPyV核酸检测,阳性结果 再进一步基因测序,并分析阳性患儿的临床资料.结果 771例患儿中WUPyV阳性15例,阳性率1.95%,其中单纯WUPyV感染9例(60%),合并其他病毒感染的有6例(40%).82例健康体检儿童WUPyV的PCR检查均阴性.所有WUPyV阳性患儿年龄均≤4岁,小2个月,大48个月,平均年龄18.8个月;男: 女=1.5:1,临床诊断主要是:支气管肺炎、细支气管炎、上呼吸道感染、支气管炎,其中1例重症患儿合并病毒性脑炎.结论 WUPyV可能是呼吸道感染病原体,其主要感染对象是婴幼儿,主要症状是咳嗽和喘息,个别有重症表现.
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地鼠多瘤病毒PCR检测方法的建立
目的 建立地鼠多瘤病毒(hamster polyomavirus,HaPyV)PCR检测方法,并应用于乙型脑炎减毒活疫苗生产过程中地鼠肾细胞的感染检测.方法 设计针对HaPyV衣壳蛋白VP1基因片段的特异引物,以含HaPyV VP1片段的质粒PMD19T-HaPyV688为模板进行PCR扩增并测序确认扩增产物.以多种病毒DNA为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行斑点杂交鉴定以验证PCR方法的特异性.将定量的质粒PMD19T-HaPyV688 10倍系列稀释后进行PCR敏感性检测.以小鼠多瘤病毒(murine polyomavirus,MuPyV)检验PCR法对质粒DNA和病毒DNA检测的一致性.应用建立的方法对生产用地鼠肾细胞悬液进行HaPyV DNA检测.结果 仅含有质粒PMD19T-HaPyV688和MuPyV DNA的样品能够扩增出600 bp的片段,经斑点杂交及测序证明其分别为HaPyV和MuPyV的VP1特异基因片段.PCR所能检出的PMD19T-HaPyV688和MuPyV的少DNA拷贝数分别为5300和590.7个亚批生产用地鼠肾细胞悬液的HaPyV检测结果均为阴性.结论 建立的PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于生产用地鼠肾细胞HaPyV感染的检测.
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Merkel细胞癌多瘤病毒阳性的皮肤原发性Merkel细胞癌二例
目的 报道Merkel细胞癌多瘤病毒阳性的Merkel细胞癌2例.方法 对诊治的2例Merkel细胞癌进行光镜观察及免疫组化标记,聚合酶链反应(PCR)检测Me.el细胞癌多瘤病毒并测序.结果 2例均为男性,例1右下肢胫前肿物1年余,皮肤科检查见右胫前密集粉红色结节,融合成10 cm×8 cm肿块,质硬,部分表面糜烂伴渗出及结痂,肿块周围亦可见多个大小不一的红色结节,活动性差.例2左膝肿物6月余,皮肤科检查见左膝内侧5 cm×4 cm紫蓝色结节型肿物,质硬,边界不清,活动性差.2例患者皮损组织病理表现相似,肿瘤细胞大小一致,细胞核大、深染,染色质细腻,核分裂象易见;胞质少,红染.免疫组化:广谱细胞角蛋白(pan-CK)、细胞角蛋白20(CK20)、突触素(Syn)、嗜铬素(CgA)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)均阳性,Ki-67(≥60％)阳性;细胞角蛋白7(CK7)、S100蛋白、HMB45、CD34、甲状腺转录因子1(TTF-1)和白细胞共同抗原(LCA)表达均阴性.2例Merkel细胞癌均经PCR检测到Merkel细胞癌多瘤病毒,而5例皮肤T细胞淋巴瘤、2例正常人皮肤和2例T细胞淋巴瘤细胞系MAC1和MAC2A均未检测到Merkel细胞癌多瘤病毒.结论 Merkel细胞癌具有特征性的临床和组织病理表现,免疫组化标记、PCR检测Merkel细胞癌多瘤病毒对明确诊断具有重要作用.
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多瘤病毒BK研究的新进展
自1971年首次报道多瘤病毒家族成员BK病毒(BKV)以来,随着研究的不断深入,已证实BKV跟临床上多种疾病相关.BKV已引起临床上特别是肾移植领域的更多的关注.本文对近5年来对BKV研究的主要新进展作一综述.
关键词： 多瘤病毒属
