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p38α丝裂原活化蛋白激酶在食管鳞癌细胞Eca109中的功能研究
目的 探讨p38α丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在食管鳞癌细胞Eca109中的可能作用.方法 构建p38α特异性的shRNA干扰载体,瞬时转染Eca109细胞,运用qRT-PCR、免疫印迹分别检测p38α干扰后在mRNA、蛋白水平上的沉默效果；运用MTT和流式细胞仪检测p38α干扰后Eca109细胞增殖,细胞周期和凋亡的变化；运用细胞划痕实验检测p38α干扰后细胞迁移能力的改变.作为平行反向验证,转染含有p38α全长cDNA的真核过表达质粒,运用免疫印迹检测p38α过表达后在蛋白水平上的表达效果；运用MTT和流式细胞仪检测p38α过表达后细胞增殖,细胞周期和凋亡的变化；运用细胞划痕实验检测p38α的变化后细胞迁移能力的改变.结果 p38α基因在受干扰后,测定其蛋白水平表达水平(22.970±2.857)较空质粒组(35.658 ±2.286)降低,差异具有统计学意义(t=-4.475,P＜0.01).观察Eca109细胞的增殖变化,发现干扰48 h后吸光度值(0.951±0.086)大于对照组细胞(0.811 ±0.012)(t=3.20,P＜0.05),表明Eca109细胞增殖加快.观察细胞周期和凋亡变化发现,干扰48 h后凋亡率(17.400±5.495)较空质粒组(1.000 ±0.721)增加(t=40.06,P＜0.01)；干扰72 h后细胞迁移速度(0.034±0.031)较空质粒组(0.278±0.021)加快(t=-5.79,P＜0.01),表明浸润能力增加.p38α在过表达后,检测到其内源性p38α蛋白表达水平(41.170±2.357)高于对照组(35.658±2.286)(t=4.41,P=0.005)；48 h过表达组吸光值(0.472±0.089)与对照组细胞吸光值(0.811±0.012)相比,细胞增殖受到抑制(t=-7.50,P＜0.01),细胞生长活动在G1期受阻(t=4.80,P＜0.01),并且其细胞凋亡(32.233±1.457)高于空质粒组(1.000±0.721)(t=17.20,P＜0.01),细胞迁移[(0.770±0.054) mm]较空质粒组[(0.278±0.021) mm]减慢并且浸润受到抑制(t=11.00,P＜0.01).结论 p38dMARK抑制食管鳞癌细胞Eca109的发生发展过程.
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大鼠全脑缺血后各脑区p38α MAPK的表达
[目的]探讨全脑缺血性损伤后p38α MAPK和GFAP在不同脑区以及各时相的表达特点及其相互关系.[方法]复制四血管脑缺血模型,取缺血10、20、30 min再灌注6、24、72、96 h的脑切片行甲苯胺蓝染色,p38aMAPK、GFAP免疫组化染色并作平均光密度(IOD)分析,p38α MAPK、GFAP荧光双染.[结果]随着缺血、缺血再灌注时间的延长,p38a MAPK主要表达在海马、皮质、尾状核,平均光密度在缺血10 min、20 min,再灌注6h时与假手术组无差异,后随缺血、再灌注时间增长逐渐加强至72 h后下降;双染结果显示部分细胞GFAP、p38a MAPK共表达.[结论]p38α MAPK和GFAP参与早期脑缺血再灌注时神经元的损伤,p38a MAPK与脑缺血后星形胶质细胞活化有关.
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小鼠缺血性脑卒中后microRNA-128的表达及其对p38α MAPK调控作用的研究
目的:探讨p38α蛋白在脑缺血后2 h降低的原因以及p38α蛋白水平表达是否受调于microRNA-128.方法:首先通过qPCR和Western blotting来检测p38α mRNA和蛋白的表达水平,其次通过生物信息学软件预测出p38α的表达可能受调于microRNA-128,后进行细胞水平验证,使用携带有microRNA-128序列质粒的慢病毒载体、携带有microRNA-128反义序列质粒的慢病毒载体以及相应空质粒的慢病毒载体转染SH-SY5Y细胞,观察p38α蛋白的表达情况.结果:小鼠脑缺血后2 h p38α mRNA水平无降低,但其蛋白水平却明显下降,microRNA-128的表达水平明显升高;转染实验发现,转染microRNA-128序列质粒的慢病毒载体的细胞p38α蛋白水平明显降低,转染microRNA-128反义序列质粒的慢病毒载体的细胞p38α蛋白水平明显升高.结论:脑缺血后p38α蛋白的表达水平下降并不是因为p38α mRNA水平的降低,microRNA-128可以调控p38α蛋白的表达,可能是通过结合p38α的mRNA从而抑制其蛋白的翻译表达.
关键词： 脑缺血 microRNA-128 p38α 调控 小鼠 -
p38α及β亚型对胰腺癌细胞生物学行为的影响
目的 观察p38亚型α和β对胰腺癌细胞生物学行为的影响.方法 Western blot实验检测人胰腺癌细胞株中p38α、p38β、p38γ、p38δ的表达;建立稳定转染靶向抑制p38α和p38β表达水平的细胞克隆,通过噻唑蓝(MTT)比色、克隆形成实验、运动轨迹、细胞侵袭、裸鼠体内成瘤等实验观察p38α和p38β对胰腺癌细胞增殖、生长、侵袭以及体内成瘤能力的影响.结果 p38 4个亚型在7种胰腺癌细胞株中有不同水平表达;选择性抑制p38α后,Mia Paca-2和Panc-1细胞增殖、运动和侵袭能力显著下降,且裸鼠体内成瘤实验可见肿瘤体积显著增加.选择性抑制p38β后,可以观察到细胞生长和增殖变慢,但未见运动和侵袭能力的变化.体内成瘤实验中,Mia Paca-2两个下调p38β细胞克隆成瘤率分别为18.3％和50.0％,较野生型和空质粒转染组显著下降,且肿瘤体积显著减小(P ＜0.05);Panc-1两个下调p38β细胞克隆成瘤率为25.0％和12.5％,较野生型和空质粒转染组显著下降(P＜0.05).结论 p38在胰腺癌细胞中表达,其亚型p38α和p38β对胰腺癌Mia Paca-2和Panc-1细胞生物学行为的影响存在不同作用.
关键词： p38丝裂酶原活化蛋白激酶 胰腺癌 p38α p38β -
miR-124通过p38α抑制小胶质细胞分泌促炎细胞因子
目的 探讨miR-124对小胶质细胞分泌促炎细胞因子的调控作用及其机制. 方法 (1)用不同浓度梯度脂多糖(LPS)和不同时间刺激BV-2小胶质细胞活化,RT-qPCR检测BV-2细胞中miR-124的表达.(2)将细胞均分为4组:PBS组、LPS组、LPS+ ctrl-模拟物组(LPS刺激后转染含无义序列的ctrl-模拟物);LPS+miR-124模拟物组(LPS刺激后转染miR-124模拟物).RT-qPCR和ELISA检测各组细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)mRNA和蛋白水平的表达变化,Western blotting检测p38α、细胞外调节蛋白激酶(ERK)及其磷酸化水平的变化.(3)在上述分组基础上增设4组:LPS+VX702组、LPS+miR-124抑制剂组、LPS+VX702+miR-124模拟物组、LPS+VX702+miR-124抑制剂组,后2组将BV-2细胞经p38α特异性抑制VX702预处理后,转染miR-124模拟物和抑制剂,LPS刺激其活化.ELISA检测TNF-α和IL-1β表达的变化. 结果 (1)LPS刺激后BV-2细胞中miR-124表达明显下降,与未刺激细胞相比,差异有统计学意义(P＞0.05),且呈浓度和时间依赖性.(2)与LPS+ctrl-模拟物组相比,LPS+miR-124模拟物组细胞TNF-α和IL-1β mRNA、蛋白的表达水平均显著降低,p38α及p-p38α的表达量亦显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05);但2组间ERK及p-ERK的表达差异无统计学意义(P＞0.05).(3)VX702预处理后,LPS+VX702+miR-124模拟物组细胞与LPS+VX702组细胞相比,TNF-α和IL-1β的分泌量差异无统计学意义(P＞0.05).LPS+VX702+miR-124抑制剂组与LPS+VX702组相比,TNF-α和IL-1β的表达差异亦无统计学意义(P＞0.05). 结论 过表达miR-124可抑制LPS诱导的促炎细胞因子分泌,其机制可能与调控p38α的表达有关.
