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厦门市O157:H7肠出血性大肠埃希氏菌调查分析
目的了解厦门市家畜,水产品,外环境中O157:H7大肠菌的带菌情况,为防治提供依据. 方法 2002年5～10月采集本市家畜粪便标本,外环境污水及水产品等标本,用E.coli O157试条对样品进行初筛,初筛阳性的样品再进行分离培养鉴定.用VITEK(GNS-120卡)对所分离菌进行NCCLS推荐的14种药敏实验. 结果在厦门市107头猪和44只羊中各分离出一株O157:H7,在324份水产品中分离出3株O157:H7,所分离的5株O157:H7对所测14种药物敏感度高. 结论本次所分离5株O157:H714种药敏实验全部敏感,可指导临床用药.本市家畜和水产品中存在O157:H7大肠杆菌,要加强监测.
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肠出血型大肠埃希菌O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体的制备和初步纯化
目的 制备肠出血型大肠埃希菌(EHEC) O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体并初步纯化.方法 生物信息学方法分析EHEC O157:H7 EspF蛋白的柔韧性、亲水性、表面可能性及抗原表位,选取1条由15个氨基酸残基组成的多肽为半抗原,在其C端偶联钥孔血蓝蛋白(KLH),免疫新西兰大白兔制备抗血清.ELISA测定抗血清效价,免疫印迹法鉴定其特异性,辛酸-硫酸铵法初步纯化抗血清,SDS-PAGE检测抗体纯度.结果 选择EspF蛋白抗原指数高的肽段72-TPSRPAPPPPTSGQA- 86 (0.506)为半抗原,合成抗原多肽经高效液相色谱鉴定,纯度为95.78％,经质谱分析其分子量为1 563.76 Mr,与目的多肽分子量一致；加强免疫3次后,EHEC O157:H7 EspF蛋白的抗血清效价达1∶2048 000;该血清对EHEC O157:H7野生株和espF突变株(△espF)的EspF蛋白均有特异性,并经辛酸-硫酸铵法获得一定纯度的抗体.结论 成功地制备了效价高、特异性强的EHEC O157:H7 EspF蛋白多克隆抗体.
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寡核苷酸阵列芯片快速鉴定大肠杆菌O157:H7初步研究
目的 设计、制作一种微型化寡核苷酸阵列芯片,评价快速鉴定肠出血性大肠杆菌O157:H7的效果.方法 多重PCR扩增大肠杆菌O157:H7七个特异性基因位点(rfbE、flicH7、intimin、Shiga-like toxins Ⅰ and Ⅱ、hemolysin A和uidA),通过PCR反应掺入SpectrumOrangTM-dUTP获取荧光标记的靶序列,与制备的芯片寡核苷酸探针杂交.结果 寡核苷酸阵列芯片检测结果与试验预期相符,获取的杂交图分辨效果明显优于多重PCR琼脂糖凝胶电泳.结论 基于玻片的寡核苷酸阵列芯片制作简便,鉴定病原菌检测细菌毒力因子快速、灵敏、特异,有良好的应用前景.
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肠出血性大肠杆菌O157:H7志贺毒素ⅡA1亚单位单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定
目的 制备出高效价的抗志贺毒素ⅡA1亚单位(STX2A1)的单克隆抗体.方法 以重组GST-SIX2A1融合蛋白作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,运用细胞杂交瘤技术制备,以天然STX2毒素为筛选抗原,采用间接ELISA法筛选产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株;以体内诱生法产生腹水,并采用Protein A-Sepharose柱对其纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚类,采用间接ELISA相加实验鉴定抗原识别表位.结果 获得3株产生针对STX2A1的单克隆抗体细胞株STX2-1A3、STX2-1E10、STX2-3A7,Ig亚类分别为IgG1λ型、IgG1κ型和IgG3κ,亲和力常数分别为5.76×109、1.21×109和3.97×108.结论 成功制备3株稳定分泌抗STX2A1的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体特异性好,亲和力高,能与天然STX2A亚单位反应.
