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基于HRM的常见伞形科香辛料快速鉴定
目的:4种香辛料小茴香、孜然、葛缕子、莳萝子与其混伪品蛇床子、防风子因外形特征相似,易混淆使用,带来安全隐患.针对鉴别困难的问题,建立高分辨率熔解曲线(HRM)分析法,以实现简便、快速鉴别的目的.方法:收集这4种香辛料及常见混伪品蛇床子、防风子共23份样本,作为参照样本,提取总DNA,基于内转录间隔区2(ITS2)序列通过聚合酶链式反应(PCR)进一步确定物种,并应用HRM技术建立检测方法和熔解曲线模型.香辛料市场收集这4种香辛料共17份样本,作为市场样本,通过HRM技术鉴定物种是否与标签相符.结果:小茴香、孜然、葛缕子、莳萝子、蛇床子、防风子的熔解曲线均表现出良好差异性,能明显区分开;17份市场样本中,编号N1和N3样品熔解曲线与标签显示的莳萝子熔解曲线具有明显差异,进一步测序结果显示二者均为毒芹子.结论:HRM技术能实现小茴香等伞形科香辛料及其混伪品间的可视化鉴别,可作为DNA条形码技术的有力补充,在中药资源鉴定中应用前景广阔.
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五味子与南五味子药材的DNA条形码鉴定
目的:利用内转录间隔区2(ITS2)序列对五味子及南五味子药材进行DNA条形码鉴定.方法:对五味子和南五味子样品的ITS2序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和测序.从GenBank中下载了五味子属10个近缘种和2个外类群的ITS2序列.利用CodonCode Aligner软件拼接,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建聚类树(NJ树),应用Blast法进行鉴定分析.获取所测样品序列的ITS2二级结构信息,分析各样品间ITS2序列二级结构的差异.结果:五味子、南五味子样品序列长度分别为231,225～ 227 bp,Blast鉴定五昧子药材原植物为五味子Schisandra chinensis,南五味子药材原植物为华中五味子S.sphenanthera.五昧子与南五味子药材的种间K2P遗传距离(0.010 4 ～0.015 7)远大于五味子种内K2P遗传距离(0 ～0.002 5)和南五味子种内K2P遗传距离(0 ～0.005 1).在NJ树模型中,五味子样品被独聚为1支,南五味子样品被独聚为1支,皆表现出单系性,Bootstrap支持率较高,可与五味子属近缘种区分开.结论:以ITS2序列为标准的DNA条形码能够有效地鉴定五味子和南五味子药材.
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基于ITS2序列的茄科酸浆属植物的DNA分子鉴定
目的:利用内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对茄科酸浆属植物进行分子鉴定.方法:对酸浆属与散血丹属植物样本的ITS2序列进行逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增和测序.为扩大研究范围,从GenBank 中下载了上述2个属植物样本的ITS2序列.所有序列经CodonCode Aligner V3.0.1软件拼接,DNAMAN软件比对分析,采用MEGA 5.10计算相关数据,基于K2P模型构建邻接聚类树.从ITS2数据库中获得所测样本及下载序列的ITS2二级结构信息,分析各样本间ITS2序列二级结构的差异.结果:从邻接聚类树分析可知,所有样本被聚为两大支.酸浆属植物自成1支,散血丹属植物为1支,且除极个别样本外,2个属的各物种种内样本可各为1支,表现出单系性;且每2支之间的Bootstrap支持率均很高.结论:ITS2序列在近缘物种间的系统学研究、品种的鉴定方面具有较大的应用潜力,适用于酸浆属植物的分子鉴定.
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广西三地广州管圆线虫亲缘关系研究
目的 分析和判定广西钦州、靖西、藤县三地广州管圆线虫(A ngiostrongylus cantonensis)分离株的基因差异和系统发生关系. 方法 从广西钦州、靖西、藤县采集野生蛞蝓,分离广州管圆线虫三期幼虫.提取广州管圆线虫三期幼虫的基因组DNA,特异性扩增内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)基因并测序,与GenBank中的广州管圆线虫序列进行比对,分析基因变异.应用Mega5.05软件构建系统发生树,分析系统发生关系. 结果 从三地共采集623条蛞蝓,其中阳性蛞蝓共283条,平均感染率为45.4％.其中靖西感染率高,为52.4％;藤县和钦州感染率分别为49.1％和19.3％.特异性扩增的ITS2长度为700 bp.GenBank检索获广州管圆线虫(A.cantone ns is)、A.dujardini以及脉居管圆线虫(A.vasorum)的相应序列为对照序列,枯病菌(Rhizoctonia solani)的相应序列为构建系统发生树的根(root)序列.广州管圆线虫钦州分离株、靖西分离株、藤县分离株与GenBank中的广州管圆线虫序列的同源性分别为99.5％、99.5％和99.7％;靖西分离株与藤县分离株、GenBank中广州管圆线虫序列的同源性分别为100％和99.5％;藤县分离株与及GenBank中广州管圆线虫序列的同源性为99.5％.三个分离株与A.dujardini、脉居管圆线虫(A.vasorum)的同源性低.以广州管圆线虫为标准株,靖西分离株有11处碱基变异,变异率为1.93％;钦州分离株有6处,变异率为1.05％;藤县分离株有15处,变异率为2.63％,TG短序列重复插入突变明显.在大似然法(maximum likelihood method)和邻接法(neighbor-joining method)构建的系统发生树上,靖西、钦州及藤县的分离株与广州管圆线虫同属一个分枝,系统发生关系较近,A.dujardini、脉居管圆线虫居于另一分枝. 结论 广西三地的广州管圆线虫分离株存在较高的遗传多态性,与GenBank中的广州管圆线虫同源性高,亲缘关系近,初步判断三个分离株与GenBank中广州管圆线虫为同一虫种.
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广东省南澳岛广州管圆线虫遗传多样性调查
目的 研究广东省南澳岛广州管圆线虫(Angiostronglus cantonensis)遗传多样性,分析其与中国不同地区分离株间的系统发生关系. 方法 2015-2016年采用分层随机抽样法在南澳岛抽取3个行政村(宫前村、金山村和六都村),选取55个采样点.用鼠笼捕鼠,解剖鼠类收集广州管圆线虫成虫.现场采集福寿螺(Pomacea canaliculata)和玛瑙螺(Achatina fulica),从螺类收集Ⅲ期幼虫,实验室感染SD大鼠后收集成虫.提取成虫基因组DNA,PCR扩增核糖体DNA内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)和线粒体DNA细胞色素氧化酶Ⅰ亚基(cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,CO Ⅰ)并测序,运用ClustalX 1.83比对序列,DnaSP5.10分析其序列组成及遗传多样性.从GenBank上获取浙江温州(登录号HQ540551.1)、广东深圳(登录号HQ540546.1)、台湾花莲(登录号KF591125.1)等中国不同地区分离株的ITS2序列,运用Mega6.06基于Kumara 双参数模型计算遗传距离,用邻接法(NJ)和大简约法(MP)构建系统进化树,分析各地区分离株的亲缘关系. 结果 从南澳岛共捕获鼠类110只,广州管圆线虫感染阳性率为29.1％ (32/110);分别检测福寿螺和玛瑙螺1 190只和24只,广州管圆线虫感染阳性率分别为6.1％ (72/1 190)和83.3％ (20/24).PCR结果显示,广州管圆线虫ITS2和CO Ⅰ片段长度分别为693和1 174 bp,位点变异率分别为4.7％和1.0％.南澳岛广州管圆线虫ITS2基因单倍型多样性指数为0.927,核苷酸多样性指数为0.007,平均核苷酸差异指数为4.549.CO Ⅰ基因单倍型多样性指数为0.440,核苷酸多样性指数为0.004,平均核苷酸差异指数为3.743.基于ITS2的分析结果显示,南澳岛与国内其他地区分离株遗传距离为0.181 ～～0.775,NJ法MP法构建的系统进化树基本一致,南澳岛大部分虫体序列与广东深圳、福建福清、云南普洱、广西南宁的分离株同属一大分支,小部分则单独聚成一支. 结论 南澳岛广州管圆线虫种群内存在一定程度的遗传分化和遗传多样性,其虫体可能存在多种类型和来源,但尚需进一步研究.
关键词： 广州管圆线虫 内转录间隔区2 细胞色素氧化酶Ⅰ亚基 遗传多样性 亲缘关系 -
常见曲霉菌的反向斑点杂交技术的研究
目的 建立常见曲霉菌的反向斑点杂交诊断技术.方法 针对曲霉菌内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)保守基因设计引物和杂交探针,对探针标记、固定在尼龙膜,形成一种杂交膜与PCR产物进行斑点杂交,显色.结果 真菌通用引物扩增常见曲霉菌ITS2基因DNA片段,大小为350bp左右.构建了常见曲霉菌的反向斑点杂交膜,与其PCR产物反应特异性好,灵敏度高.结论 利用PCR技术和反向斑点杂交技术鉴定常见的曲霉菌,方法特异性好、灵敏度高,符合临床需要,能为侵袭性真菌感染提供新的选择.
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常见曲霉菌的实时定量PCR诊断技术的研究
目的 建立常见曲霉菌的实时定量PCR诊断技术.方法 针对黄曲霉菌、烟曲霉菌、构巢曲霉菌、黑曲霉菌和土曲霉菌内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)保守基因设计引物和探针,通过普通PCR扩增其ITS2基因片段,作为实时定量PCR反应模板,通过实时定量扩增和分析其解链曲线来鉴定常见曲霉菌,同时分析该方法灵敏度.结果 真菌通用引物扩增五种常见曲霉菌ITS2基因DNA片段,大小为350 bp左右.实时定量PCR分析和探针解链曲线分析结果显示土曲霉解链温度(melting temperature,Tm)值为57℃±0.12℃,黄曲霉Tm值为59℃±0.13℃,烟曲霉Tm值为63℃±0.17℃,土曲霉Tm值为66℃±0.15℃,构巢曲霉Tm值为66℃±0.14℃,黑曲霉Tm值为68℃±0.12℃.方法 灵敏度分析显示各曲霉菌低模板DNA反应浓度分别为烟曲霉51.2· fg/μl,黄曲霉621.3 fg/μl,黑曲霉19.5 fg/μl,土曲霉82.4 fg/μl和构巢曲霉520.8fg/μl.结论 创建一种可快速鉴定五种常见曲霉菌的实时定量PCR诊断技术,该方法特异度好、灵敏度高,符合临床需要,能为侵袭性真菌感染(invasive aspergillosis,IA)提供新的选择.
