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乌苯美司诱导肾癌细胞死亡的作用及机制
目的 观察乌苯美司对肾癌细胞增殖及死亡的影响并探讨其可能机制.方法 利用WST-8细胞增殖实验及细胞生长曲线检测乌苯美司对肾癌细胞增殖能力的影响;LDH释放实验检测乌苯美司对肾癌细胞死亡的影响;酶活性测定法及Westem blotting研究乌苯美司诱导肾癌细胞APN活性及表达;Western blotting及免疫组化染色观察乌苯美司的作用靶点氨肽酶N(APN)/CD13在肾癌组织及正常组织中的表达.结果 乌苯美司不能降低肾癌细胞中APN的表达但是可以抑制其活性;乌苯美司可抑制肾癌细胞增殖及活力,诱导细胞自噬性死亡.结论 乌苯美司可抑制肾癌细胞增殖,并可通过诱导自噬引发肾癌细胞死亡.
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荷叶提取物黄酮对兔胆囊结石形成的影响
目的:研究荷叶提取物黄酮对兔胆囊结石形成的影响及机制.方法:45只雄性新西兰兔,随机均分成对照组、结石组和黄酮组,分别喂食普通饮食、含1.2 g/d胆固醇的成石饮食、含1.2 g/d胆固醇和0.4 g/d的黄酮饮食. 采用RT-PCR方法检测肝脏氨肽酶N mRNA(APNmRNA)水平的变化,用放射免疫法检测血清亮氨酸氨肽酶(LAP)表达及血脂.结果: 结石组10只出现胆囊结石,12只出现胆固醇结晶,黄酮组和对照组无结石及结晶出现;结石组APN mRNA IOD比值(1.08±0.35)明显高于对照组(0.65±0.18)和黄酮组(0.87±0.44);结石组血清总胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇、载脂蛋白B(apoB)与黄酮组相比明显升高(P＜0.01),高密度脂蛋白有降低趋势,但无显著性差异(P＞0.05);结石组血清载脂蛋白A(apoA) 降低(P＜0.05);结石组LAP明显高于对照组和黄酮组(P＜0.01).结论:荷叶提取物黄酮可改变血脂水平、降低肝脏APN的表达和血清LAP,从而有助于防止胆囊胆固醇结石的形成.
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紫草素对脑胶质瘤细胞氨肽酶N活性的影响及机制
目的 探讨紫草素对脑胶质瘤细胞氨肽酶N活性的影响及机制.方法 本文采用酶抑制动力学方法,研究了紫草素对氨肽酶N的抑制作用、抑制类型和抑制动力学常数,并进行了脑胶质瘤U251细胞的凋亡生长抑制实验及不同浓度紫草素溶液在氨肽酶N溶液中的荧光光谱测定、圆二色光谱测定.结果 紫草素能可逆的竞争性抑制氨肽酶N的活性(半数抑制率IC50为93.59 μmol·L-1,抑制常数Ki为32.74 μmol·L-1);随着孵化时间的增加,不同浓度紫草素对氨肽酶N的相对活性无影响,其对脑胶质瘤U251细胞的半数抑制浓度为66.12 μmol·L-1;紫草素可浓度依赖性的促进氨肽酶N内源性荧光发生猝灭效应,两者的结合常数Ka为4.12×104L·mo1-1,热力学参数△H和△S分别为38.64 kJ·mol-1和179.21 J/(mol·K);紫草素还可诱导氨肽酶N构象的解折叠,使α-螺旋含量增加到32.1％,β-折叠含量减小到22.9％.结论 紫草素是一种可逆的竞争型氨肽酶N抑制剂,其可迅速降低酶的活性,并诱导脑胶质瘤U251细胞的凋亡.紫草素的作用可能通过猝灭氨肽酶N的内源性荧光并诱导氨肽酶N构象的解折叠,使α-螺旋含量增加而实现的.
关键词： 紫草素 脑胶质瘤U251细胞 氨肽酶N 荧光光谱 -
蛇床子素抑制膀胱癌细胞生长和侵袭的机制
目的:探讨蛇床子素对表皮生长因子受体酪氨酸激酶(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase,EGFR-TPK)、基质金属蛋白酶(matrix-metalloproteinase-2,MMP-2)和氨肽酶N(aminopeptidaseN,APN)的抑制作用,并阐明蛇床子素抑制膀胱癌T24细胞生长和侵袭的机制.方法:利用分光光度法研究蛇床子素对T24细胞EGFR-TPK,APN,MMP-2和caspase-3活性的影响,利用MTT法测定蛇床子素对膀胱癌T24细胞和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1生长的抑制作用,采用Transwell小室法分析蛇床子素对膀胱癌T24细胞转移能力;Western印迹检测培养液中加入蛇床子素后,人膀胱癌细胞株T24中COX-2,VEGF及β-actin的表达;采用非放射性NF-κB凝胶迁移或电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)试剂盒测定T24细胞中NF-κB活性.结果:蛇床子素对EGFR-TPK,APN和MMP-2的半数抑制浓度(IC50)分别为(45.33±3.98),(28.21±3.23)和(8.11±0.54) μmnol/L;随着蛇床子素浓度的增加,膀胱癌T24细胞生长抑制率不断增高,与空白对照组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05);但SV-HUC-1细胞的生长并未受到明显的抑制;与空白对照组比较,蛇床子素组穿膜细胞的数减少(P＜0.05);膀胱癌T24细胞中凋亡蛋白caspase-3活性显著增强(P＜0.05);蛇床子素能够下调NF-κB,COX-2及VEGF的表达.结论:低毒性的蛇床子素可能通过降低EGFR-TPK,APN和MMP-2活性和NF-κB,COX-2及VEGF的表达,激活caspase-3活性的方式,对膀胱肿瘤细胞的侵袭、增殖和血管生成产生抑制作用.
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氨肽酶N启动子调控的MnSOD基因对骨髓细胞的特异性辐射防护作用
背景与目的:骨髓造血细胞中导入耐辐射基因是克服放疗对造血系统抑制作用的有效手段,但这也增加了肿瘤细胞的辐射耐受性.本实验旨在探索不明显增加肿瘤细胞对辐射抗拒性的同时,能特异性保护骨髓细胞免受辐射导致的损伤的方法.方法:构建以氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)基因骨髓特异性启动子调控的锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)基因逆转录病毒载体,并导入成骨髓细胞KG1a和肝癌细胞BEL7402中.用RT-PCR分析MnSOD mRNA水平,测定细胞中MnSOD活性,以细胞存活实验检测骨髓细胞和肝癌细胞对X射线的敏感性,并用流式细胞术和断裂DNA电泳方法对辐射诱导的细胞凋亡进行分析.结果:导入基因的KG1a细胞中MnSOD mRNA水平和酶活性明显升高.APN骨髓特异性启动子调控的MnSOD基因表达能有效抑制辐射引起的KG1a细胞凋亡.导入基因的KG1a细胞对辐射的耐受性提高,在用10Gy剂量照射时,KG1a细胞存活率比原来增加3.7倍.而导入MnSOD基因并未使BEL7402细胞中MnSOD mRNA水平和酶活性提高,其放射敏感性未发生明显变化.结论:APN骨髓特异性启动子能控制MnSOD基因在骨髓细胞中高表达,而在癌细胞中低表达.在用X射线杀伤癌细胞的过程中,APN骨髓特异性启动子调控的MnSOD基因能特异性保护骨髓细胞.
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汉黄芩素对肺癌肿瘤细胞生长和转移抑制作用机制的研究
目的:探讨明胶酶(MMP-2)、表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶(EGFR-TPK)和氨肽酶N(APN)抑制剂汉黄芩素对肺癌细胞的生长和转移抑制机制.方法:本文采用酶抑制学方法,研究了汉黄芩素(0 ～ 100 μmol/L)对MMP-2、APN和EGFR-TPK的抑制作用,并进一步的分析了汉黄芩素(0 ～ 100μmol/L)对肺癌A549的生长、细胞转移的抑制作用和A549细胞中TIMP-2和TGF-β1表达水平的影响,酶标仪吸光度法检测细胞凋亡蛋白Caspase 3活性.结果:汉黄芩素能够抑制MMP-2、APN和EGFR-TPK的活性(汉黄芩素半抑制浓度IC50分别为7.26±0.33、7.11±0.43和5.32±0.22 μmol/L)和诱导A549的凋亡(汉黄芩素半抑制浓度IC50为49.13±4.90μmol/L);随着汉黄芩素作用浓度(1、10、50、100μmol/L)的增加,TGF-β1表达均呈现降低趋势,TIMP-2的表达呈增加趋势,且A549细胞穿过人工基底膜的能力下降而凋亡蛋白Caspase 3活性增加.结论:汉黄芩素通过诱导TIMP-2表达增强和TGF-β1表达的降低,对MMP-2、APN和EGFR-TPK的活性产生抑制作用,对Caspase 3活性产生激活作用,终对肺癌A549细胞的转移和凋亡起到重要作用.
