首页 > 文献资料
-
运用抑制性消减杂交技术构建糖尿病肾阳虚证DNA消减文库
目的:运用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建糖尿病(Diabetic mellitus,DM)肾阳虚证DNA消减文库.方法:选择汉族中医辨证为肾阳虚证的DM患者以及正常人做对照组,进行正向和反向消减杂交.用Rsa Ⅰ酶切用硅胶法抽提基因组DNA成大小不等的片段,分别连接两种不同的接头,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U/A载体连接,经蓝白斑筛选及菌液PCR筛选出阳性重组质粒,构建DM肾阳虚证DNA消减文库.结果:用SSH方法筛选出DM肾阳虚证的差异DNA片段,经克隆及PCR筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DM肾阳虚证的DNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DM肾阳虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DM肾阳虚证相关基因奠定了基础.
-
糖尿病肾病肾阴虚证DNA消减文库的构建
在多年糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾虚证的研究中,结果发现血管紧张素Ⅰ转换酶(angiotensin Ⅰ-converting enzyme,ACE)基因多态性与肾阴虚证密切相关[1].这提示肾阴虚证存在其相关基因.目前克隆疾病的相关基因有多种方法,其中抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)对研究复杂基因组的差异基因具有一定的优越性.目的:采用抑制性消减杂交技术(suppression sub-tractive hybridization,SSH)构建汉族人糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾阴虚证DNA消减文库.方法:选择汉族DN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.用硅胶法抽提血白细胞DNA,用RsaⅠ酶切基因组DNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建DN肾阴虚证DNA消减文库.结果:用SSH方法筛选出了DN肾阴虚证的差异DNA片段,得到586个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了DN肾阴虚证的DNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异DNA片段以构建DN肾阴虚证DNA消减文库,为进一步筛选和克隆DN肾阴虚证相关基因奠定了基础.
-
慢性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建
目的:采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建汉族人慢性肾炎(CGN)肾阴虚证cDNA消减文库.方法:选择汉族人CGN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及2次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阴虚证消减文库.结果:用SSH方法筛选出了CGN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了386个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阴虚证的cDNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阴虚证相关基因奠定了基础.
-
狼疮性肾炎肾阴虚证cDNA消减文库的构建
目的:采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人狼疮性肾炎(Lupus Nephritis LN)肾阴虚证cDNA消减文库.方法:选择汉族人LN且中医辨证为肾阴虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和消减杂交.采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNA Template)技术逆转录并扩增总cDNA,用RsaI酶切基因组cDNA成大小不等的片段,分别与两种不同的接头连接,进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将PCR产物与U载体连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建LN肾阴虚证消减文库.结果:用SSH方法筛选出了LN肾阴虚证的差异cDNA片段,得到了450个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了LN肾阴虚证的cDNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建LN肾阴虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆LN肾阴虚证相关基因奠定了基础.
-
慢性肾炎肾阳虚证cDNA消减文库的构建
目的:采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建汉族人慢性肾炎(chronicglomerulonephritis CGN)肾阳虚证cDNA消减文库.方法:选择汉族人CGN且中医辨证为肾阳虚证的患者以及正常人作为其对照组,进行正向和反向消减杂交.采用Trizol一步法提取总RNA,用SMART(Switch Mechanism At 5 end of RNATemplate)技术逆转录并扩增总cDNA,用Rsa Ⅰ酶切基因组cDNA成大小不等的片断,分别与两种不同的接头连接,进行2次消减杂交及两交抑制性PCR,建立抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),在SSH基础上进行镜像选择(mirror orientation selection,MOS),将PCR产物与U载本连接,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建CGN肾阳虚证消减文库.结果:用SSH方法筛选出了CGN肾阳虚证的差异cDNA片段,得到了443个白色克隆,再经PCR方法快速筛选出阳性重组质粒,从而成功地构建了CGN肾阳虚证的cDNA消减文库.结论:SSH技术能够快速有效地分离差异cDNA片段以构建CGN肾阳虚证cDNA消减文库,为进一步筛选和克隆CGN肾阳虚证相关基因奠定了基础.
