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利用DGGE和454测序研究不同浙贝母种源对根际土壤真菌群落的影响
探讨不同种源浙贝母根际真菌群落多样性差异,以了解浙贝母的土壤微生态机制.利用变性凝胶梯度电泳(DGGE)和454焦磷酸测序技术检测不同种源浙贝在同一块地种植其根际真菌的多样性及组成.DGGE结果表明,本地种源(宁波种)根际真菌Shannon指数高于南通和磐安种源.测序结果显示宁波产地的浙贝根际真菌主要由子囊菌、半知菌、接合菌以及一些未知真菌组成.其中,3个种源根际大部分真菌种类相同,但每个种源均有特异性真菌.454测序结果发现磐安本地种真菌多样性高于宁波和南通等外地种,与DGGE结果相同,这可能是本地种进化适应的结果.磐安实验地的根际土真菌包括Fungi_incertae_sedis,Ascomycota,Mucoromycotina,Basidiomycota,Chytridiomycota等10个门,其中前5门几乎占据了整个群落的90％,其真菌的种类和数量均超过宁波实验地,充分显示出产地的差异以及宏基因组测序的优越性.磐安种根际真菌隶属于10门29科28属159种,宁波种6门20科19属136种,南通种8门37科47属289种,非根际土则隶属于7门25科24属102种.其中Dothidea,Capnobotryella,Conidiobolus等属仅存在南通种,而Pyrenochaeta,Glomus,Pseudonectria等则只存于磐安种,暗示这些真菌的存在与浙贝母相关.种源和产地实验发现本地种的真菌多样性高于外地种,每个种源根际均有特异性真菌,说明根际真菌多样性及组成是由浙贝母种源和产区的土壤类型共同决定,而这些真菌等微生物通过与土壤-根际微生态系统的互作,反过来会进一步影响浙贝母的生长.
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种植年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响
为探寻栽培年限对杭白芍根际细菌群落及芍药苷含量的影响,揭示根际土壤微生态与杭白芍品质的关系,收集了1～4年杭白芍的根及根际土壤,利用PCR-DGGE检测土壤菌群多样性;利用HPLC检测根中芍药苷含量.结果表明,种植杭白芍能明显降低土壤的酸性,并随着栽培年份增加pH酸性持续下降,到第4年时土壤pH、酶活均达到高,而有机质含量则低.变性凝胶梯度电泳检测1～4年的根际细菌多样性在3.38 ～3.61,多样性随栽培年限而上升,说明杭白芍的生长会促进土壤中的细菌多样性.测序结果表明,杭白芍土壤中的优势细菌为γ变形菌、α变形菌、放线菌、酸杆菌及厚壁菌等,其中,根际特异菌主要为α变形菌、酸杆菌Gp1及放线菌;而在非根际土中γ变形菌为特异优势菌群.此外,1～4年的杭白芍根际优势细菌组成基本相似,只有少数种类随年份发生改变,表明根际细菌群落的组成主要受杭白芍物种的影响.HPLC检测结果表明,1～4年杭白芍的芍药苷质量分数分别为3.26％,3.30％,3.36％,3.41％,均超过国家标准,且随生长年份呈上升态势,但无显著性差异.相关性分析可知,芍药苷含量与土壤pH、细菌多样性呈显著正相关,与有机质呈显著负相关.与其他有连作障碍的作物不同的是,随着栽培年限的延长,杭白芍根际的pH和细菌多样性不降反升,但优势菌群变化不大,这可能是该植物不产生连作障碍的原因之一.研究表明,农业实践中之所以选择4年采收杭白芍根入药的原因之一主要是产量而不是有效成分含量.此外,研究还发现有效成分芍药苷的累积与土壤pH、有机质和细菌多样性关系密切,证明杭白芍的道地性与土壤微生态环境密切相关.
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浙贝母土壤真菌DNA提取方法的优化
[目的]由于土壤理化性质的复杂性和真菌细胞壁结构的特殊性,从土壤样品中提取真菌基因组DNA往往比较困难,本实验通过方法优化以寻找适合浙贝母土壤真菌DNA的佳方法.[方法]分别采用传统玻璃珠法,Ultra CleanTM土壤DNA提取试剂盒法及改进的试剂盒法等3种方法,提取宁波浙贝母种植区的根际土壤微生物总DNA,利用巢式PCR扩增真菌DNA片段.[结果]3种方法均可提取土壤微生物总DNA.其中改进的试剂盒法提取的DNA电泳结果条带清晰,试剂盒法提取的DNA电泳结果次之,传统玻璃珠法提取的DNA电泳条带不清晰,且有拖尾.对上述三种方法所提取的DNA做巢式PCR分析真菌特异性,传统方法电泳无目的条带,试剂盒法只有第一次PCR电泳有目的条带,只有改进的UltracleanTM土壤DNA提取试剂盒法终获得了350 bp左右的目的条带,而且利用变性凝胶梯度电泳技术(Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)成功地检测到不同种源以及根际与非根际土中微生物的差异.因此认为改进的试剂盒法为提取土壤真菌DNA的优选择.[结论]在土壤真菌DNA提取中,合适的振荡方法是土壤真菌能否破壁的关键性因素.
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饮水中地塞米松污染对小鼠肠道菌群的影响
目的 探讨水环境地塞米松污染对小鼠肠道菌群的影响.方法 将20只Balb/c小鼠随机分为对照组和实验组,每组5只.实验低剂量组灌喂含 0.035 ng地塞米松磷酸钠的饮用水,中剂量组为0.225 ng、高剂量组为2.25 ng,对照组灌喂不含地塞米松磷酸钠的饮用水.每日观察小鼠行为、皮毛、大便等的变化.灌喂第36 d处死小鼠,取回盲部组织提取细菌基因组DNA,扩增16S rDNA V6可变区,扩增产物变性凝胶梯度电泳(DGGE)后分析.切取DGGE图谱上的优势条带,扩增、纯化后克隆测序,其序列BLAST比对分析.结果 各实验组小鼠均出现性情暴躁、斗殴打架、咬断尾部等现象.DGGE图谱聚类分析表明各组小鼠回盲部均具有较稳定的菌群;主成分分析表明各组的优势菌群存在一定差异;菌群多样性分析表明,与对照组相比,低剂量组菌群的种类和数量明显增加(P＜0.05);中、高剂量组种类和数量显著增加(P＜0.01).16S rDNA V6区序列分析显示实验组和对照组具有共有菌属15种、差异菌属2种,优势菌种类和比例发生了改变.对照组有乳杆菌属的细菌定植,而中、高剂量实验组乳杆菌属的细菌消失,却出现志贺菌属的细菌.结论 饮水地塞米松污染可影响小鼠神经系统,使小鼠肠道内细菌的种类、数量及优势菌所占的比例发生改变,菌群多样性增加;抑制肠道益生菌的定植,利于肠道致病菌的入侵.
