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禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测方法的建立
为了对致病性强、危害性大的H5、H7、H9亚型禽流感病毒进行同时集成化快速检测,通过对GenBank已报道的禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了H5、H7、H9 3个亚型的特异性引物和分别用3个荧光基团标记的Taqman MGB核酸探针.将各个亚型引物与探针优化组合,筛选出能够同时检测禽流感病毒 H5、H7、H9 3个亚型、且对Ct值和扩增效率影响不大的3组引物和探针,建立了三重实时荧光RT-PCR方法.该方法特异性好,在我们检测的样品中,没有发现假阳性和假阴性现象.同时敏感性高,检测禽流感病毒 H5、H7、H9亚型的敏感性分别达到1 000、1 000、500个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对禽流感H5、H7、H9 3个亚型的不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测3个病毒亚型.所建立的方法对保存的89个禽流感病毒样品进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定、HA、HI)的符合率达100%.用上述建立的方法与鸡胚分离法同时对新鲜采集的4 000多份临床样品进行检测,两种方法的检测结果符合率为100%.
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十堰市2012年不同场所禽流感H5与H9检测结果分析
目的 了解2012年湖北省十堰市五类场所禽流感H5与H9亚型分布特点,为有效防控禽流感提供依据.方法 选择十堰市与禽类有接触的且有代表性的五类场所(野生候鸟栖息地、城乡活禽农贸市场、大型家禽屠宰加工厂、大型家禽养殖场、家禽散养户集中地区),按季度采集不同种类的外环境标本302份,采用Real-time PCR方法进行检测,使用SPSS 17.0软件对数据进行分析.结果 2012年五类场所FIuA的检出率为26.82％(81/302),H5亚型检出率为5.96％ (18/302),H9亚型检出率为17.88％ (54/302),H5-H9亚型环境分布差异有统计学意义(x2=6.0,P=0.014);五类场所中集中散养户与大型家禽养殖场未检测到FIuA阳性标本,野生候鸟栖息地检测到1例(1.69％),活禽农贸市场37例(64.91％),大型家禽屠宰厂43例(56.58％);活禽农贸市场与大型家禽屠宰厂H5检出率明显低于H9亚型,差异有统计学意义(x2=7.784、21.564,P＜0.05);不同标本种类对FluA、H5与H9阳性检出率有影响,采样季节对其检出率无影响.结论 十堰市五类场所禽流感病毒以H9亚型为主;相关部门应重点监测与防控活禽农贸市场和大型家禽屠宰厂.
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多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立
目的 参考AIV M基因和HA基因序列,设计了两对引物.其中XZ145-2和XZ146为通用引物,可以检测所有亚型AIV,跨幅244 bp;XZ H9-1和XZ H9-2为H9亚型特异性引物,跨幅488 bp.方法 利用这两对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,成功建立了快速检测鉴别H9亚型AIV的多重RT-PCR技术.结果与结论 特异性和敏感性试验结果表明,该技术对H9亚型AIV同时扩增出两条大小分别为244 bp和488 bp的cDNA片段,对其他亚型AIV只扩增出244bp的cDNA片段,对其他常见禽病病原无特异性扩增,结果为阴性;该多重RT-PCR的通用引物对AIV RNA的低检出量为1pg,对H9亚型RNA的低检出量为10 pg.
关键词： 多重反转录聚合酶链反应 禽流感病毒 H9亚型 -
2015-2016年深圳市H5和H9亚型禽流感病毒外环境分布
目的 了解深圳市活禽市场外环境中禽流感病毒的分布情况,为进一步探索和预测人禽流感变化规律提供参考.方法 在全市10个区分别设立一个采样点,采集相应的外环境拭子标本,采用荧光定量PCR方法检测甲型流感病毒(FluA),以及H5和H9亚型病毒核酸.结果 2015年12月至2016年5月共采集外环境标本1204份.FluA的核酸检测阳性率为66.7%,H5亚型阳性率为30.2%,H9亚型阳性率为33.1%,H5和H9亚型检测均为阳性的,阳性率为15.9%.H5与H9亚型差异无统计学意义(χ2=2.219,P>0.05).结论 深圳市活禽市场外环境存在禽流感病毒污染,H5亚型与H9亚型同时存在,且阳性率均在30%以上,有明显的混合感染,表明二者之间存在着发生重配的可能.
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2013年云浮市外环境禽流感病毒分布监测分析
目的 了解云浮市禽类规模养殖场和活禽市场外环境中禽流感病毒的分布情况,为防控人感染高致病性禽流感提供科学依据.方法 在监测点内采集相应的外环境标本,采用荧光定量PCR方法检测FluA、H5、H7和H9病毒核酸.结果 2013年全年共采集有效标本234份,A型阳性42份,总阳性率为18.0％(42/234);其中A(H5)5份(11.9％),A(H9)22份(52.4％),未分型15份(35.7％),A(H7)未检出.234份有效标本中,来自家禽规模养殖场107份,未检出A型阳性;来自城乡活禽市场127份,A型阳性42份,阳性率为33.1％(42/127),两类监测点标本阳性率的差异有统计学意义(x2=43.1,P＜0.01).除禽类饮水标本外,5种类型标本(宰杀或摆放禽肉案板表面的擦拭标本、笼具表面擦拭物、清洗禽类的污水、粪便)阳性率差异有统计学意义(x2=7.85,P＜0.05).有采样的月份均可检出A型阳性,一、三、四季度阳性检出率相当,二季度低.结论 云浮市外环境存在禽流感病毒污染,H9亚型是主要的病原体,同时存在H5和其他亚型禽流感病毒污染,活禽市场是人感染高致病性禽流感的高风险场所.
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2009-2011年十堰市H5与H9亚型禽流感检测结果分析
目的 了解禽流感病毒H5与H9亚型在不同场所外环境的分布状况,为禽流感防控提供依据.方法 在2009-2011年间,选择十堰市内与禽类有接触的5类场所,按季度采集不同种类的标本373份,采用Real-time PCR方法对标本进行禽流感病毒特异性核酸检测,结果使用SPSS 17.0进行统计分析.结果 检测标本中甲型流感病毒(FluA)的检出率为16.09％,H5亚型检出率为7.51％,H9亚型检出率为6.7％,H5 +H9亚型检出率为4.56％,H5与H9亚型差异无统计学意义(x2 =0.067,P=0.796 ＞0.05);不同标本种类之间检出率差异有统计学意义(x2=45.816,P＜0.05),鸡内脏FluA、H5、H9和H5 +H9检出率依次为40％、18.33％、16.67％和11.67％;不同的采样场所对检出率有影响(x2=91.241,P＜0.05),活禽农贸市场与大型家禽屠宰厂FluA、H5、H9和H5+H9检出率为64％、36％、34％、32％与42.5％、25％、20％、5％,采样季节对FluA总检出率无影响(x2=6.780,P=0.079 ＞0.05).结论 十堰市流行着H5与H9亚型禽流感病毒,接触禽类内脏及活禽农贸市场和大型家禽屠宰厂是感染禽流感的高危因素.
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抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的: 制备抗禽流感病毒(AIV)H9亚型血凝素蛋白的单克隆抗体(mAb).方法: 以AIV H9亚型油乳剂灭活疫苗作为免疫原, 免疫8 wk龄BALB/c小鼠.采用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗AIV H9亚型血凝素蛋白的mAb; 采用ELISA和血凝抑制试验(HI)检测腹水mAb的效价; 采用ELISA、 HI、免疫荧光染色(IF)及Western blot鉴定mAb的特异性.结果: 获得3株可稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株2A3、 2H1和1C8, 其腹水mAb的ELISA效价依次为1×107、 1×105和5×106, 血凝抑制效价为1×28～1×213; 3株mAb的Ig亚类均为IgG1.以mAb 2H1进行Western blot的结果显示, 该mAb能与AIV的Mr为75 000的蛋白条带起反应, 表明其是针对AIV H9亚型血凝素蛋白的mAb.与32株AIV H9亚型国内分离株进行血凝抑制试验表明, mAb 2H1具有良好的广谱性.结论: 成功地制备了抗AIV H9亚型血凝素蛋白的mAb, 为AIV的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量的监测及流行病学调查等奠定了基础.
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2014年菏泽市城乡活禽市场禽流感病毒监测结果分析
目的:2014年菏泽市城乡活禽市场禽流感病毒监测结果分析.方法:在菏泽市随机选取的城乡活禽市场采集外环境标本256份,荧光RT-PCR进行禽流感病毒H5、H7、H9亚型核酸检测.结果:256份外环境标本中,共检出A型禽流感病毒阳性89份,阳性率34.77％;不同类型标本之间A型禽流感病毒阳性率无统计学差异;不同类型标本之间H5亚型禽流感病毒分布无统计学差异,H9亚型禽流感病毒分布有统计学差异.结论:有关部门应加强对城乡活禽市场活动人员消毒防范的宣传,降低禽流感潜在感染的风险.
