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全长cDNA感染性克隆文献资料
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乙型脑炎减毒活疫苗株全长感染性克隆的构建及表达外源基因的初步研究
通过构建乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的全长cDNA克隆,来初步探讨将其作为表达载体的可行性,为下一步利用乙型脑炎病毒作为载体构建嵌合病毒打下基础.利用长片段RT-PCR的方法分两段扩增出乙型脑炎病毒cDNA,通过片段两端的酶切位点,将cDNA依次连接到pACYC184载体.进一步利用分子克隆的手段,在乙型脑炎病毒基因组cDNA的3 '非编码区插入增强型绿色荧光蛋白(Ehanced green fluorescent portein,EGFP)基因作为报告基因,通过体外转录和转染,拯救乙型脑炎病毒和表达绿色荧光蛋白的乙型脑炎嵌合病毒.采用RT-PCR、蚀斑实验和荧光显微镜观察等方法对恢复病毒进行鉴定.对恢复病毒进行连续6次细胞传代,从病毒生长特性和结构基因稳定性的角度对恢复病毒传代稳定性进行研究.结果表明成功地扩增并构建得到乙型脑炎病毒的全长cDNA,在此基础上进一步构建得到了乙型脑炎嵌合病毒rJEV-EGFP全长cDNA,经过体外转录和转染获得了活的rJEV病毒及嵌合病毒rJEV-EGFP,并采用了多种方法对其进行了鉴定,拯救出的恢复病毒在已传代的代次内稳定性良好,嵌合病毒rJEV-EGFP可稳定地表达绿色荧光蛋白.本研究应用反向遗传学技术构建并在BHK-21细胞中成功地拯救出了rJEV和rJEV-EGFP活病毒,同时也表明乙型脑炎病毒SA14-14-2株可以作为载体来表达外源基因.
关键词： 乙型脑炎病毒 反向遗传学 全长cDNA感染性克隆 表达载体 增强型绿色荧光蛋白
