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共表达甲型流感病毒M1和HA双基因的重组腺病毒的构建及鉴定
以我国分离的首株人H5N1亚型禽流感病毒(A/Anhui/1/2005)作为研究对象,通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),构建共表达H5N1亚型禽流感病毒膜蛋白基因M1和HA的重组腺病毒.PCR扩增禽流感病毒H5N1亚型M1和HA基因的全长可读框片段,先后亚克隆入pStar载体,然后扩增M1-IRES-HA片段并将其插入穿梭载体pShuttle-CMV,再与pAd-Easy载体在BJ5183菌中通过同源重组产生重组腺病毒载体,转化293细胞,包装出重组腺病毒Ad-M1/HA.将Ad-M1/HA感染293细胞,可观察到明显细胞病变效应,用免疫荧光及Westernblot方法均检测到M1和HA基因的表达.共表达M1和HA双基因的重组腺病毒的成功构建为开发新型重组腺病毒流感疫苗奠定了基础.
关键词： M1蛋白 血凝素 内部核糖体进入位点序列 腺病毒载体 -
人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因共表达腺病毒载体的构建及鉴定
背景:内部核糖体进入位点序列载体能将上下游基因共同转录,故通过此载体可使连接在一起的人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2同时高表达,可为骨缺损的治疗提供新方法.目的:实验通过引入内部核糖体进入位点序列,采用基于attLXattR的λ噬茵体位点特异性重组系统的GatewayTM技术构建带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体并进行鉴定.方法:用聚合酶链反应方法扩增人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2目的基因,将两个基因亚克隆至pIRES2-EGFP载体中,构建phBMP2-IRES-hFGF2载体,通过BP反应将hBMP2-IRES-hFGF2重组到载体pDONR221中,再通过LR反应将其转移到腺病毒载体pAd/CMV/V5-DEST中,线性化后转染293细胞进行包装获得重组腺病毒Ad-hBMP2-IRES-hFGF2.结果与结论:phBMP2-IRES-hFGF2经酶切及测序鉴定正确,带hBMP2-IRES-hFGF2的载体在293细胞中包装成功,获得成熟的病毒颗粒,病毒滴度为2.82×1010 ifu/mL,证实成功构建了带有人骨形态发生蛋白2和人成纤维细胞生长因子2双基因重组腺病毒载体.
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Klotho基因真核表达载体的构建及其在TCMK-1细胞中的稳定表达
目的 构建小鼠Klotho基因真核表达载体,进而获得稳定表达Klotho分子的小鼠肾上皮细胞株TCMK-1.方法 应用PCR方法扩增带有FLAG标签的Klotho编码基因,并克隆至载体pCD-CXIN(CMV-MCS-IRES-Neomycin)的相应位点;经酶切及测序鉴定重组质粒,脂质体转染TCMK-1细胞,通过G418筛选得到稳定表达Klotho分子的TCMK-1细胞株;Real-Time PCR检测Klotho mRNA水平,Western blotting检测Klotho蛋白的表达.结果 将带有FLAG标签的Klotho基因重组表达载体转染至TCMK-1细胞后,经G418筛选获得TCMK-1细胞株.与对照组相比,Klotho mRNA和蛋白表达均显著升高.结论 成功构建了Klotho基因的重组表达载体,并获得了稳定表达Klotho基因的TCMK-1细胞株,为进一步研究Klotho基因和蛋白在小鼠肾上皮细胞中的作用奠定了基础.
关键词： klotho 内部核糖体进入位点序列 FLAG标签 TCMK-1细胞 -
smad7和uPA双基因共表达重组腺病毒载体的构建和鉴定
目的通过引入内部核糖体进入位点序列,构建并鉴定smad7和uPA基因共表达的腺病毒载体.方法PCR扩增uPA和smad7全长cDNA的片段,先后亚克隆入pIRES质粒;更换酶切位点后,将smad7-IRES-uPA片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,再与pAdEasy-1质粒在RJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.酶切鉴定后在293细胞中包装成重组腺病毒Adsmad7/uPA.RT-PCR检测Adsmad7/uPA在L02肝细胞中的表达.结果该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,均与预期结果一致;转染AD-293细胞后,2天可观察到GFP明显表达;RT-PCR检测到转染后的L02细胞中smad7和uPA表达增强.结论成功构建了smad7和uPA双基因共表达重组腺病毒载体,为研究mad7和uPA双基因共表达对大鼠肝纤维化的预防、治疗作用奠定基础.
关键词： Smad7 尿激酶型纤溶酶原激活剂 内部核糖体进入位点序列 基因治疗 腺病毒 -
hVEGF165及hBMP-7双基因共表达腺相关病毒载体的构建及鉴定
目的 通过引入内部核糖体进入位点序列(internal ribosome entry site, IRES),构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒载体(adeno-associated virus, AAV),并对其进行鉴定.方法 以AAV腺相关病毒包装系统(helper-free system)为基础,将真核表达质粒pIRES中的IRES片段定向克隆至腺相关病毒骨架质粒pAAV-MCS中,形成含有IRES序列及上、下游多克隆位点的重组骨架质粒pAAV-MCS A-IRES-MCS B.PCR扩增hVEGF165和hBMP-7基因,先后亚克隆入重组腺相关病毒骨架质粒IRES序列上、下游的多克隆位点,获得重组质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7.将其和包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper三质粒共转染AAV-293细胞,包装重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,同时包装含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)标记的重组病毒rAAV-IRES-GFP作平行对照.荧光显微镜下监测病毒包装效率,收获重组病毒后感染AAV-HT1080细胞测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果 重组腺相关病毒骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7经双酶切鉴定正确.荧光显微镜下观察三质粒共转染AAV-293细胞72h后,病毒包装效率达95%～100%,收获的重组病毒具有较高浓度及活性,感染AAV-HT1080效率达90%,荧光计数法测定病毒感染滴度达5.5×1011vp/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的 基因hVEGF165及hBMP-7片段,重组病毒包装成功.结论 成功构建带有hVEGF165及hBMP-7双基因的重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-IRES-hBMP-7,收获的病毒具有较高滴度,为今后利用腺相关病毒载体进行hVEGF165及hBMP-7双基因共表达影响骨修复的体外及体内研究提供实验基础.
关键词： 腺相关病毒载体 VEGF BMP 内部核糖体进入位点序列
