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促甲状腺激素生物素-链亲和素TRFIA定量检测法的建立
用Eu3+标记链亲和素(SA),分别用两株识别人促甲状腺素(human thyroid stimulating hormone,hTSH)的单克隆抗体包被96微孔板并生物素化,建立了高灵敏的hTSH生物素-链亲和素(BAS)时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)检测法.本法的灵敏度为0.02mIU/L;批内CV为2.7%～3.5%,批间CV为3.2%～3.8%;平均回收率为100.26%;与电化学发光免疫分析技术(ECLIA)比对,相关系数达0.9544, 线性方程为Y=1.3133X-32.297;与ECLIA临床测定值也呈明显相关;正常值范围为0.33～3.09mIU/L.本文建立的hTSH-BAS-TRFIA具有灵敏度高,特异性强,稳定性好,测定范围宽,检测时间短和非放射性等优点,具有良好的应用价值.
关键词： 促甲状腺激素 时间分辨荧光免疫分析 生物素-链亲和素 -
内毒素诱导性基因启动子结合蛋白的筛选新方法及其应用
目的 建立研究DNA-蛋白质相互作用的新方法.方法 选择6只SPF级BALB/c小鼠,模型组经尾静脉注射脂多糖(LPS)25 mg/kg,使平均动脉压(MAP)降至40 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)造成内毒素休克,然后迅速处死,正常对照组同期处死,取肝脏组织.利用生物素-链亲和素系统结合磁珠分离技术筛选内毒素诱导基因(LIG)启动子的结合蛋白.用聚合酶链反应(PCR)扩增末端带生物素标记的LIG启动子探针,提取动物肝脏组织胞核蛋白,与制备的LIG启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离LIG启动子-蛋白反应复合物,使用不同浓度NaCl洗脱结合的蛋白,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较模型组与正常对照组的差异条带.结果 两组胞核蛋白中共观察到15条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,LPS作用后有4个蛋白开始与LIG启动子作用力增强,而有1个蛋白则同启动子的相互作用减弱;在DNA-蛋白质高亲和力作用水平,则有9个蛋白因LPS刺激而同DNA的结合力增强,有1个蛋白同启动子的相互作用消失.结论 成功建立了生物素-链亲和素结合磁珠分离技术的新方法,为研究DNA-蛋白质相互作用开拓了新思路,并从"转录调控组学"角度深入理解基因表达调控机制奠定了基础.
关键词： DNA-蛋白质相互作用 启动子 生物素-链亲和素 基因表达调控 -
利用生物素-链亲和素系统筛选呼吸机所致肺损伤HMGB1启动子结合蛋白
目的:筛选呼吸机所致肺损伤(VILI)高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的启动子结合蛋白.方法:制备VILI大鼠模型,与正常对照组大鼠同期处死,取肺组织提取细胞核蛋白.用PCR法扩增末端带生物素标记的HMGB1启动子探针,将细胞核蛋白与制备的HMGB1启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离HMGB1启动子-蛋白反应复合物,分别用0.25 moL/L和1 moL/L NaCl洗脱探针上结合的蛋白,SDS-PAGE电泳分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较VILI组与正常对照组的差异条带.结果:两组细胞核蛋白中共观察到24条差异条带.分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,机械通气后有6个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有2个蛋白的结合力减弱;在高亲和力作用水平,有10个蛋白与HMGB1启动子的结合力增强,有6个蛋白的结合力减弱.结论:筛选到一些VILI特异性HMGB1启动子结合蛋白,对于研究HMGB1的转录调控机制具有重要意义.
