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mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为 H/RS样细胞的影响
目的 探究mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞的影响.方法 重组SiRNA表达质粒LV-mCD99L2,体外转染内源性mCD99L2表达阳性的A20细胞,筛选出稳定表达LV质粒的细胞株并扩增培养;采用免疫荧光技术和流式细胞仪检测转化前后两组细胞鼠源CD30表达;透射电镜观察转化后细胞超微结构的形态特点;细胞计数方法动态观测培养细胞干扰组A20-LV-mCD99L2和未经干扰组A20细胞的H/RS样细胞(直径≥25 μm)转型率,以人霍奇金淋巴瘤细胞系L428作为对照;采用流式细胞仪检测细胞周期变化.结果 获得了稳定表达LV质粒的单克隆细胞株A20-LV-mCD99L2;免疫荧光标记显示转化细胞CD30(+);流式细胞仪检测A20-LV-mCD99L2细胞CD30阳性率为54.4%;透射电镜观察转化后细胞核增大,可见单核、双核及多核,核仁明显的H/RS样细胞;干扰组H/RS样细胞的转型率明显高于未经干扰组(P＜0.01).两组处于S期的细胞无明显差异,两组细胞均未见凋亡峰.结论 mCD99L2基因沉默可诱导小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞转化为H/RS样细胞.
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苯丁酸氮芥对淋巴瘤细胞凋亡信号通路的影响
目的:探讨苯丁酸氮芥对B细胞淋巴瘤细胞株A20细胞是否具有促凋亡效应及其在凋亡信号通路中的具体作用机制.方法:实验组使用终浓度为20 μmol/L的苯丁酸氮芥处理A20细胞,对照组使用PBS处理A20细胞.使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞的凋亡情况,使用Western blot检测淋巴瘤细胞中Activecaspase-3、Survivin、NF-κB和pAKT的表达,使用荧光定量PCR检测淋巴瘤细胞中Survivin mRNA的表达.结果:与对照组相比较,苯丁酸氮芥干预组的A20细胞FITC+/PI+凋亡细胞的比例显著增高,而Active caspase-3的表达显著上调(=7.384,P=0.000),Survivin mRNA的表达显著降低(t=4.384,P=0.000),Survivin蛋白的表达显著降低(t=12.360,P=0.000),NF-κB蛋白的表达显著降低(=5.462,P=0.000),pAKT的表达显著降低(=7.183,P =0.000).结论:苯丁酸氮芥促进淋巴瘤细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路、NF-κB和Survivin的表达有关.
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光动力疗法对小鼠B细胞淋巴瘤的体外和体内抗肿瘤作用
目的 从体外和体内两个方面探讨二氢卟吩e6衍生物-Photodithazine作为光敏剂(PS)的光动力疗法(PDT)对B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用.方法 对A20细胞处理不同浓度(0.125～1.0 μg/ml)光敏剂后照射激光波长为(662±3)nm,照射量为6.25 J/cm2.用水溶性四氮唑(WST-1)法测定各组细胞的增殖;用电子显微镜观察细胞形态学变化;流式细胞术(FACS)检测各组细胞的凋亡率及B细胞特异抗原CD45R的表达情况;建立Balb/c小鼠皮下移植瘤模型,对实验动物进行PDT干预后记录各组的肿瘤生长;用Western blot法检测凋亡相关蛋白的表达.结果 体外PDT治疗24 h后0.50 μg/ml浓度以上PDT组的A20细胞生长受到了抑制(P＜0.05),48 h后0.25 μg/ml浓度组细胞生长较对照组也明显抑制(P＜0.01);实施PDT后A20细胞形态有了明显变化,镜下出现凋亡细胞和死亡细胞;建立了皮下移植瘤模型,观察到体外PDT抑制了淋巴瘤动物模型中肿瘤的生长(P＜0.05);实施PDT的肿瘤组织中P53、P21及Bax等凋亡相关蛋白表达增加.结论 Photodithazine为光敏剂的PDT治疗在体内和体外对A20淋巴瘤具有抗肿瘤作用.
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mCD99L2基因沉默对小鼠B淋巴瘤细胞A20生物学特性的影响
目的 探究mCD99L2基阂沉默对小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞生物学特性的影响.方法 采用MTT法和流式细胞仪检测mCD99L2基凶沉默前后干扰组A20-LV-mCD99L2和未十扰组A20细胞的增殖率和细胞周期;Transwell法测定两组细胞的体外侵袭能力;采用裸鼠与BALB/c鼠皮下成瘤实验观察比较两组细胞在体内的成瘤时间和成瘤率.结果 MTT法显示干扰组A20-LV-mCD99L2增殖率为(0.61±0.12),低于未干扰组增殖率(0.75±0.20),差异有统计学意义(P=0.000);干扰组A20-LV-mCD99L2处于G2期的细胞比例为(10.58±4.97),高于未干扰组(3.33±1.31),差异有统计学意义(P=0.009);Transwell法显示干扰组A20-LV-mCD99L2运动能力较未干扰组下降.裸鼠皮下成瘤时间干扰组(13.33±4.63)d长于未干扰组(9.50±2.90)d,成瘤率均为100%;BALB/c鼠皮下成瘤时间干扰组(10 d)长于未干扰组(7.0±0.82)d,成瘤率干扰组为14.3%,显著低于未干扰组(100%).差异有统计学意义(P=0.000).结论 mCD99L2基因沉默可抑制小鼠B淋巴瘤细胞系A20细胞的生物学行为,降低其在体外的增殖能力和运动能力,显著降低其在BALB/c鼠体内的成瘤率.
关键词： mCD99L2 基因沉默 干扰 A20细胞 A20-LV-mCD99L2细胞 -
CPP-Id对小鼠树突细胞表面共刺激分子表达的影响
背景与目的:B细胞淋巴瘤的独特型(idiotype,Id)免疫球蛋白可作为肿瘤特异性抗原诱发免疫反应抑制肿瘤的发展.本实验拟探讨小鼠淋巴瘤细胞株A20中Id-CTL表位的存在,了解细胞穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP)负载的Id(CPP-Id)进入树突细胞(dendritic cell,DC)的量,以及在细胞内的分布和进入细胞的时相,同时检测其对DC表面标志表达的影响.方法:用RT-PCR方法扩增A20细胞株的Id抗原CTL(cytotoxicity lymphocyte)表位的基因片段,并测序确定氨基酸的序列;通过流式细胞仪检测CPP-Id与Id进入小鼠DC的量的差异及抗原负载前后的DC表型的表达;共聚焦显微镜观察CPP-Id进入细胞的过程及时间;荧光显微镜观察CPP-Id在细胞内的分布.结果:RT-PCR扩增产物为660 bp的片段,测序结果表明A20细胞株的Id抗原CTL表位的基因存在.共聚焦显微镜检测显示CPP-Id能在初200 s内快速进入DC,单纯Id进入DC的量很少.10 μmol/L的CPP-Id负载的DC细胞平均荧光强度(MFI)高于单独使用Id组(4.35±0.48 vs.1.14±0.33,P＜0.005);两者负载的DC表面标记CD80、CD86、CD54及MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子表达均比未成熟DC明显增加.结论:CPP-Id比Id进入小鼠DC的量明显增加,CPP肽可以提高Id抗原进入细胞的效率;CPP-Id体外冲击DC后,可以使DC表面MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ类分子,协同刺激分子CD80、CD86以及粘附分子CD54表达显著增高,有利于活化CTL.
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LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达
目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.
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不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨
目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞A20佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在A20细胞中的表达及作用奠定基础.方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对A20细胞的转染效率.结果:脂质体转染效率低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率高,可达80%以上.结论:对于悬浮细胞A20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值.
