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MAPK信号通路介导CT-1促进大鼠心肌细胞存活
目的 探讨心脏营养素-1(CT-1)对培养乳鼠心肌细胞存活的促进作用以及丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导途径在CT-1促进心肌细胞存活中的作用.方法 差速贴壁纯化培养新生大鼠心肌细胞,MTT比色法测定各孔细胞存活率.结果 无血清DMEM培养心肌细胞24 h后,加入4个剂量组CT-1(10-10～10-7 mol/L),呈明显剂量依赖性增加MTT计数;培养基中加入CT-1(10-8 mol/L),1、2、3和4 d MTT计数呈明显的时间依赖性增加;预先用MAPK抑制剂PD098059(5×10-5 mol/L),再加入CT-1,心肌细胞存活率明显低于单纯CT-1组,而单纯用PD098059则无明显影响;预先用PKC激动剂PMA(10-5 mol/L),再加入CT-1,MTT计数明显增加;先用PD098059,再加入PMA和CT-1,MTT计数明显降低,而先用PKC抑制剂Calphostin C(Cal)再加CT-1,MTT计数也明显降低.结论 CT-1增加心肌细胞存活率的效应是由MAPK信号分子介导实现的;该效应的胞内信号传导通路可能是先激活PKC信号分子,然后再激活MAPK信号分子.
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心脏营养素-1促进脐带间充质干细胞诱导分化为心肌样细胞时心肌α-actin、β-MHC、GATA4和 Nkx2-5基因的表达
目的：探讨心脏营养素-1（CT-1）促进经5-氮杂胞苷（5-aza）诱导的脐带间充质干细胞（UCMSCs）分化为心肌样细胞时心肌α-actin、β-MHC、GATA4、Nkx2-5基因的表达。方法分离、纯化 UCMSCs，第4代 UCMSCs 分别以普通培养基（A 组）和含0.1 nmol/L CT-1培养基（B 组）培养；经5-aza 诱导的第4代 UCMSCs 分别以普通培养基（C 组）、含不同浓度 CT-1培养基 D 组（D1组0.01 nmol/L、D2组0.1 nmol/L、D3组1.0 nmol/L）培养。应用荧光定量 PCR 检测各基因的表达。结果 UCMSCs 培养2~3 d 后细胞贴壁，逐渐由圆形变为长纤维样；经5-aza 诱导分化后可见心肌样细胞，但未见自发性搏动。RT-PCR 检测显示 B 组和 C 组α-actin、β-MHC、GATA4和 Nkx2-5基因的表达较 A 组均无明显增加；α-actin、GATA4和 Nkx2-5基因在 D 组较 A 组表达明显增加，其中α-actin 基因在 D2组表达高，GATA4基因在 D1组表达高，Nkx2-5基因在 D3组表达高，而β-MHC 基因在 D 组表达未见增加。
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洛伐他丁对心肌细胞外信号调节激酶信号传导水平及心脏营养素-1表达的影响
目的:探讨细胞外信号调节激酶(ERK)通路与甲基戊二酰辅酶A (HGM-CoA)还原酶抑制剂的关系.方法:体外培养的大鼠心肌细胞株H9c2(2-1)经洛伐他丁处理24 h和5 d,然后以免疫印迹杂交检测 p-44 ERK1、p-42 ERK2和总ERK蛋白水平,同时检测心脏营养素-1蛋白水平的变化.结果:洛伐他丁处理24 h后,ERK1、ERK2的磷酸化水平分别升高125%(P=0.041)和89%(P=0.034);处理5 d后检测ERK1、ERK2的磷酸化水平分别升高93%(P=0.021)和80%(P=0.046).培养中的大鼠心肌细胞H9c2(2-1)经过洛伐他丁处理24 h或5 d后,作为重要炎性细胞因子的心脏营养素-1水平均显著增高,其中,处理24 h后增高79.3%(P=0.004),处理5 d后增高34.8%(P=0.014).选择性抑制ERK之后,洛伐他丁处理导致心脏营养素-1水平的变化显著减弱.结论:洛伐他丁除了具有已知的降脂作用外,亦可能参与心肌细胞炎性反应的调节机制.
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重组慢病毒介导心脏营养素-1基因转染延缓小鼠失神经骨骼肌萎缩
目的 探讨重组慢病毒介导的心脏营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)基因转染延缓小鼠失神经骨骼肌萎缩的疗效.方法 将36只Swiss小鼠,随机分为实验组和对照组,每组18只,切断胫神经,建立右下失神经支配肌萎缩模型.于实验组和对照组失神经腓肠肌分别转染重组慢病毒载体Lenti-GFP-CT-1和Lenti-GFP溶液20μl(108TU/ml),转染后2、4周,每个时间点分别取3只小鼠,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、Western blot检测CT-1的表达;取6只小鼠行单次收缩力、强直收缩力的检测,测定肌湿重、肌纤维横截面积,并观察肌纤维超微结构的变化.结果 慢病毒转染2,4周,两组腓肠肌中均可见大量GFP表达.Western blot检测显示实验组失神经腓肠肌中有明显的CT-1表达(P均<0.01).转染2周,实验组肌肉单次收缩力恢复率、强直收缩力恢复率、肌湿重维持率和肌纤维横截面积分别为[(47.61±6.25)%,x-±s,下同]、(56.08±5.47)%、(63.02±5.23)%、(1372.42±149.73)μm2,均明显高于对照组,后者分别为(27.23±5.06)%、(30.78±4.67)%、(52.41±4.98)%、(1147.28±128.67)μm2(P均<0.01);4周时,实验组上述各项指标分别为(33.13±4.76)%、(36.59±5.67)%、(51.46±5.36)%、(1209.12±142.57)μm2,仍明显高于对照组,后者分别为(16.40±5.48)%、(15.35±4.08)%、(39.15±6.12)%、(989.45±136.12)μm2(P均<0.01).此外,实验组肌浆网的扩张程度明显减轻.结论 慢病毒介导的基因治疗有较高的转染效率,其介导的CT-1基因转染能有效延缓小鼠失神经骨骼肌的萎缩,其疗效至少可以维持4周.
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心脏营养素-1治疗失神经骨骼肌萎缩过程中对正常肌肉组织的影响
目的 探讨应用心脏营养素-1(cardiotrophin-1,CT-1)治疗失神经骨骼肌萎缩的有效剂量和安全剂量,观察不同剂量的CT-1对正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌的副作用.方法 取Swiss小鼠80只,随机分成8组,每组分别于胫神经切断术后连续腹腔注射重组小鼠CT-1(rmCT-1)40、60、80、100、120、140、160μg·kg-1·d-1,剩余1组腹腔注射等体积CT-1溶媒,28d后称量失神经侧腓肠肌、正常侧腓肠肌和心脏的湿重;测量胸主动脉平滑肌厚度;检测正常腓肠肌中α-actin和MHC Ⅱa以及心肌中β-MHC的表达、胸主动脉血管平滑肌细胞中α-actin的含量.结果 采用腹腔注射给药,当CT-1用量达到60μg·kg-1·d-1时,开始对失神经骨骼肌产生营养作用,并呈剂量依赖性增强,当给药剂量超过100 μg·kg-1·d-1后,出现对正常骨骼肌、心肌和血管平滑肌的影响.给药剂量达到120μg·kg-1·d-1时,开始促进心肌β-MHCmRNA的表达,增加正常心脏的湿重.当给药剂量达到140μg·kg-1·d-1时,开始促进正常骨骼肌α-actin和MHC Ⅱ amRNA的表达,以及骨骼肌湿重的增加,同时提高了主动脉血管平滑肌α-actin的含量,增加了血管平滑肌的厚度.结论 腹腔注射CT-1防治失神经骨骼肌萎缩的有效剂量为60 μg·kg-1·d-1,高安全剂量为100 μg·kg-1·d-1.当给药剂量达到120 μg·kg-1·d-1时,开始出现心肌肥厚,当给药剂量达到140 μg·kg-1·d-1时,可导致正常骨骼肌的肥大和血管平滑肌的增厚.
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心脏营养素-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用
目的探讨心脏营养素-1(Cardiotrophin-1,CT-1)及其受体在失神经骨骼肌中的表达规律,观察外源性CT-1对失神经骨骼肌的营养和保护作用.方法选用11组Swiss小鼠,每组10只,切断其右侧胫神经,分别于术后不同时间点完整切取失神经腓肠肌,用Northern blot法测定肌肉中CT-1及其受体亚基LIFR-β,gp130的mRNA含量,探讨三者的表达规律.另取Swiss小鼠30只,同样方法切断其胫神经后,连续腹腔注射CT-1(100μg/kg/d),于7、14和28 d后检测失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和肌肉总蛋白含量,观察超微结构的变化,分别与对照组比较.结果 CT-1及其受体在正常骨骼肌中均有表达.胫神经切断后,腓肠肌中CT-1的表达进行性下降;而LIFR-β和gp130在早期均有一个表达增高的过程,前者的表达高峰出现在失神经支配后24 h,后者在神经切断后1周表达高.连续应用外源性CT-1 2周,有效地维持了失神经腓肠肌的湿重、肌纤维横截面积和总蛋白含量,减轻了肌浆网的扩张程度.用药4周后,这种效果更加明显.结论内源性CT-1表达不足,是失神经骨骼肌早期萎缩的一个重要因素.受体gp130/LIFR-β的表达上调,提高了肌肉对其配体CT-1的敏感性,及时应用外源性CT-1,可对失神经骨骼肌产生营养和保护作用,能有效地延缓失神经骨骼肌的萎缩.
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心脏营养素-1及其受体在失神经骨骼肌中的表达规律
目的:探讨心脏营养素-1(CT-1)及其受体亚基gp130,白血病抑制因子受体-β(LIFR-β)在失神经骨骼肌中的表达规律.方法:选用11组Swiss小鼠,每组10只,切断其右侧胫神经,分别于不同时间点取失神经支配的腓肠肌,用Northern blot法测定肌肉中CT-1和LIFR-β,gp130的mRNA含量,探讨三者的表达规律.结果:正常肌肉组织中CT-1的表达量较高,而2个受体亚基只有低水平表达;随着骨骼肌失神经支配时间的延长,肌肉细胞中CT-1的表达进行性下降;LIFR-β和gp130均为先增高后降低,但前者的表达高峰出现在失神经支配后24 h ,而后者则在神经切断后1 wk表达高.结论:骨骼肌细胞内源性CT-1表达不足,对肌肉的保护作用减弱可能是失神经肌肉早期萎缩的一个重要因素.受体gp130/LIFR-β的表达增高为进一步研究应用外源性CT-1来防治失神经肌肉萎缩提供了理论依据.
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心脏营养素-1对失神经骨骼肌收缩功能的促进作用
目的 观察外源性心脏营养素-1(CT-1)对失神经骨骼肌收缩功能的促进作用,并探讨其机制.方法 将120只小鼠随机分为12组各10只,制作腓肠肌失神经模型,6个实验组腹腔注射重组小鼠CT-1 100μg/(kg·d),6个对照组注射等量CT-1溶媒,分别于给药后1、2、4周,检测失神经腓肠肌湿重、横截面积和收缩相关蛋白变化,并于神经修复后4、8、12周,检测神经再支配腓肠肌的复合肌肉动作电位(CMAP)和肌张力.结果 与对照组比较,实验组失神经骨骼肌湿重和纤维直径增加,α-肌动蛋白、肌球蛋白重链Ⅱ和Ca2+-ATP酶水平升高,神经再支配骨骼肌的CMAP和肌张力提高.结论 外源性CT-1可促进失神经骨骼肌重获神经支配后收缩功能的恢复;其机制为通过提高失神经骨骼肌收缩相关蛋白含量,改善失神经骨骼肌收缩的酶学基础.
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心脏营养素-1延缓失神经骨骼肌萎缩作用机制研究
目的 探讨外源性心脏营养素-1(CT-1)延缓失神经骨骼肌萎缩的作用机制.方法 将120只小鼠随机分为两组各60只,制作腓肠肌失神经模型后实验组腹腔注射CT-1 100μg/(kg·d),对照组注射等量CT-1溶媒,分别于给药后2、4、6周完整切取腓肠肌,检测骨骼肌细胞凋亡、蛋白代谢、兴奋-收缩耦联等相关指标.结果 与对照组比较,观察组Fas mRNA表达降低、Bc1-2 mRNA表达增加、骨骼肌细胞凋亡率下降;肌细胞收缩蛋白中α-肌动蛋白、肌球蛋白重链Ⅱa mRNA表达增加;肌质网Ca2+-ATP酶水平升高;但泛素、RC2 mRNA表达水平及MeHis释放量无明显差异.结论 外源性CT-1延缓失神经骨骼肌萎缩的机制为促进失神经骨骼肌结构性蛋白合成、抑制肌细胞凋亡、提高Ca2+-ATP酶水平等.
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容量超负荷诱导大鼠心脏营养素-1和血管紧张素Ⅱ含量的变化
目的 观察慢性容量超负荷在诱导大鼠心肌肥大模型中心肌组织中CT-1和Ang Ⅱ含量的变化,进而探讨其可能机制.方法 将SD大鼠随机分为正常组,伪手术组和容量负荷模型组,分别测量全心室重/体重比值、右心室重/体重比值和平均动脉压,检测血浆中肾素活性和Ang Ⅱ含量,右心室的组织切片进行免疫组织化学检测.结果 模型组与正常对照组及伪手术组比较心肌明显肥大且升高150％ (P＜ 0.01).平均动脉压模型组或伪手术组与正常组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；血浆肾素活性模型组与伪手术组比降低(P＜0.01),血浆Ang Ⅱ含量模型组与伪手术组比升高(P＜0.01);右心室CT-1免疫组化模型组与伪手术组的表达升高(P＜0.05).结论 慢性容量超负荷可诱导大鼠心肌肥大,AngⅡ和CT-1可能是参与容量超负荷诱导心肌肥大反应的重要因素.
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PKC上调心脏营养素-1促进心肌细胞的存活率
目的 观察心脏营养素-1(CT-1)对培养乳鼠心肌细胞存活率的影响以及蛋白激酶C(PKC)信号转导通路在调控CT-1诱导心肌细胞存活中的作用.方法 分离、纯化并差速贴壁培养新生大鼠心肌细胞,MTT比色法测定各孔心肌细胞存活率.结果 ①无血清DMEM培养心肌细胞24 h后加入4个剂量组CT-1(0.1～10 nmol/L),随着剂量的增加MTT计数随之增高,呈明显的剂量依赖性;②在培养介质中预先加入蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波酯(PMA),30 min后再加入CT-1,MTT计数明显增加,而用PKC抑制剂Calphostin C(Cal)则使MTT计数明显降低;③用丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)亚型细胞外信号调节激酶(ERK)选择性抑制剂PD098059进行预处理,再加入CT-1,心肌细胞存活率明显降低,与单纯CT-1组相比有显著性差异;单纯用ERK抑制剂PD098059对心肌细胞存活率无明显影响;预先加入ERK抑制剂PD098059,再加入PMA和CT-1,MTT计数明显降低,与(PMA+CT-1)组相比有极显著性差异.结论 CT-1对心肌细胞存活率具有明显的剂量依赖性;PKC可上调CT-1促进的心肌细胞存活率,PKC可能成为CT-1促进心肌细胞存活率的信号转导通路之一;CT-1诱导心肌细胞存活率的胞内信号转导通路可能是先激活PKC,然后诱导MAPK亚型ERK的激活.
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左向右分流型先天性心脏病病儿血浆BNP和CT-1变化
目的 探讨左向右分流先天性心脏病(CHD)病儿血浆脑钠肽(BNP)、心脏营养素-1(CT-1)水平的变化及临床意义.方法 应用ELISA法测定25例左向右分流CHD病儿和10例正常儿童血浆BNP和CT-1水平,观察血浆BNP和CT-1水平与肺动脉压力、左心室射血分数(EF)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室舒张末内径(LVIDd)、左心室收缩末内径(LVIDs)和左心室心肌质量指数(LVMI)的关系.结果 与正常儿童比较,左向右分流CHD病儿血浆BNP和CT-1水平明显升高(t=9.50、3.07,P<0.01);肺动脉高压病儿血浆CT-1水平明显高于正常肺动脉压病儿(t=10.92,P<0.01),且左向右分流CHD病儿血浆CT-1水平与肺动脉压力呈正相关(r=0.512,P<0.05),但与EF、FS、LVIDd、LVIDs和LVMI无相关性(P>0.05);左向右分流CHD病儿血浆BNP水平与EF、FS、LVIDd、LVIDs、LVMI和肺动脉压力均无相关性(P>0.05).结论 血浆BNP和CT-1水平能较好地反映左向右分流型CHD病儿的心功能状态,血浆CT-1水平随肺动脉压力升高而升高.
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CT-1对神经再支配骨骼肌功能恢复的促进作用
目的 探讨经心脏营养素-1(CT-1)治疗后的失神经骨骼肌重获神经支配后的功能恢复情况.方法 60只 Swiss小鼠,切断右侧胫神经,随机分成2组,其中一组每天注射外源性CT-1(100 μg/kg),另外一组注射等量CT-1溶媒,1个月后修复胫神经.分别于4、8和12周后检测再生胫神经的有髓神经纤维数、神经再支配骨骼肌的复合肌肉动作电位(CMAP)和肌张力,并与对照组比较.结果 与对照组相比,CT-1注射组的再生神经有髓神经纤维数、重获神经支配后的骨骼肌的CMAP和肌张力均有显著提高(t′=6.39～43.36,P<0.01).结论 CT-1具有促进神经再生和改善骨骼肌收缩功能的双重作用,有效促进了神经再支配骨骼肌的功能恢复.
