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腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立
目的 建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统.方法 利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee12#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas9细胞验证该载体的基因敲除效率.筛选睾丸组织特异表达基因Sycp3的sgRNA靶点,构建入AAV-sgRNA(新版)载体中,进行病毒包装,利用显微注射技术将病毒注射入小鼠睾丸组织曲细精管内,通过T7E1分析体内细胞的基因敲除效果.结果 构建成功的AAV-sgRNA载体能够进行病毒包装并在体外细胞水平上对人源Wee1进行基因编辑,与慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统中的载体编辑效率相比无明显差异.同时,该系统能在体内水平对Sycp3进行基因编辑.结论 成功建立一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的思路和方法.
关键词： CRISPRCas9 AAV 病毒包装 T7E1 显微注射 -
比较T7E1和Surveyor核酸内切酶对于点突变的检测效率
目的:比较T7E1和Surveyor核酸内切酶对于CRISPR-Cas9引起的点突变的错配剪切活性.方法:利用野生型和点突变的基因组DNA为模板,PCR扩增出突变位置的基因片段,用不同比例的野生型和点突变的PCR产物进行DNA杂交,分别用T7E1和Surveyor核酸内切酶对杂交后的产物进行切割,琼脂糖凝胶电泳分析结果.结果:当5％点突变DNA与95％野生型DNA杂交时,T7E1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为9.5％,Surveyor核酸内切酶为3.2％;当点突变DNA与野生型DNA等比例杂交时,T7E1核酸内切酶剪切杂交产物的比例为45.6％,Surveyor核酸内切酶为26.4％;且T7E1和Surveyor核酸内切酶均能检测5％的突变DNA.结论:T7E1核酸内切酶检测点突变的效率高于Surveyor.
