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腺相关病毒介导的体内睾丸组织基因特异性敲除系统的建立
目的 建立一套可用于体内睾丸组织特异性敲除基因的系统.方法 利用同源重组技术将CRISPR/Cas9系统中sgRNA功能元件插入到AAV表达载体,将人源Wee12#sgRNA构建入改造的AAV-sgRNA(新版)载体中进行病毒包装,并感染稳定表达Cas9的HeLa-spCas9细胞验证该载体的基因敲除效率.筛选睾丸组织特异表达基因Sycp3的sgRNA靶点,构建入AAV-sgRNA(新版)载体中,进行病毒包装,利用显微注射技术将病毒注射入小鼠睾丸组织曲细精管内,通过T7E1分析体内细胞的基因敲除效果.结果 构建成功的AAV-sgRNA载体能够进行病毒包装并在体外细胞水平上对人源Wee1进行基因编辑,与慢病毒介导的CRISPR/Cas9系统中的载体编辑效率相比无明显差异.同时,该系统能在体内水平对Sycp3进行基因编辑.结论 成功建立一套可用于在体内睾丸组织中进行特异性敲除目标基因的系统,为生殖体内功能研究提供一个新的思路和方法.
关键词： CRISPRCas9 AAV 病毒包装 T7E1 显微注射 -
腺相关病毒介导的心肌基因转染在心脏移植中的应用
目的:探讨在不同转导方法下,将外源性基因转入供体心脏的可行性.方法:将携带报告基因半乳糖苷酶基酶(LacZ)的病毒载体经三种办法转导供体心脏方法:直接心肌注射法,经冠状动脉单次灌注法,组织胺预处理+经冠状动脉单次灌注法.心脏移植21 d后,供体心脏进行组织学检查,分析报告基因转染和表达.结果:经冠状动脉单次灌注法,组织胺预处理+经冠状动脉单次灌注法处理的两组移植心脏中未发现有报告基因的表达,直接心肌注射法组的移植物中发现有高效表达的报告基因.结论:在非生理状态下,经冠状动脉单次灌注病毒载体不能有效转染外源性基因,直接心肌注射法在心脏移植中是可行的.
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局部抑制TLR2对牙周炎小鼠牙槽骨吸收的影响
目的:探讨局部抑制 TLR2对牙周炎小鼠牙槽骨吸收的影响.方法:取 BALB/cJ 小鼠45只,随机分为疾病组、治疗组、正常组(n=15),其中正常组小鼠不做任何处理;疾病组和治疗组采用口腔植入牙龈卟啉单胞菌(Pg)的方式建立牙周炎模型后,分别感染AAV-sh-Luc-YFP病毒和AAV-sh-TLR2病毒.1周后收集各组小鼠颌骨样本,上颌骨用亚甲基蓝染色法从颊侧观察牙槽骨吸收情况;下颌骨样本进行脱钙、石蜡包埋后进行连续切片,苏木精-伊红(HE)染色法观察小鼠牙槽嵴顶区域的骨吸收情况.结果:治疗组小鼠颊侧牙周组织骨吸收量明显少于疾病组(P<0.05),与正常组相比无明显差异(P>0.05).治疗组小鼠牙槽嵴顶区域的骨吸收量明显少于疾病组,与正常组相比则无统计学差异(P >0.05).结论:局部抑制TLR2可明显降低牙周炎疾病中牙槽骨的吸收.
