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抗菌肽P18抑制喉癌细胞Hep-2增殖
抗菌肽能广谱杀伤包括耐药菌株在内的细菌、某些真菌、寄生虫、部分病毒以及肿瘤细胞,具有微量高效、快速、广谱的特点.抗菌肽P18是天蚕素A和爪蟾素2通过连接和替换某些氨基酸设计出的抗菌肽P18[1],其有更强的抗菌活性,并且对K562、Jurkat等多种肿瘤细胞系有抗癌效果,同时不会诱导溶血.而有关抗菌肽P18对喉癌方面的研究国内外报道较少,本研究成功构建真核表达载体,表达出融合蛋白对于Hep-2细胞增殖具有一定抑制作用,这为其后续作用机制的研究提供了依据.
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家蝇天蚕素对人肝癌BEL-7402细胞的作用靶点
将家蝇天蚕素(终浓度50μmol/L)加入对数生长期的人肝癌BEL-7402细胞中作用12 h,扫描电镜观察天蚕素对人肝癌细胞细胞膜的影响.在此基础上,采用绿色荧光素异硫氰酸(FTTC)标记天蚕素,运用激光共聚焦显微镜观察FTTC标记的天蚕素与人肝癌细胞细胞膜的作用.肿瘤细胞经天蚕素作用12h后,扫描电镜显示细胞膜表面微绒毛大部分消失;激光共聚焦显微镜显示大部分天蚕素与细胞膜结合,细胞内也发现部分天蚕素进入.
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家蝇Cecropin A分子体外表达及抗菌活性鉴定
目的 体外重组表达家蝇天蚕素多肽分子,并对重组表达产物活性进行初步鉴定.方法 克隆家蝇天蚕素成熟肽(Mature Cecropin,MC)基因,构建pET32a-MC重组质粒.转化大肠杆菌(E.coli) BL21(DE3)中.1 mmol/L终浓度的IPTG诱导重组蛋白Thioredoxin(硫氧还蛋白,Trx)-MC表达.重组蛋白质纯化回收后经胃蛋白酶水解获得天蚕素多肽分子.用重组蛋白和天蚕素多肽分子进行抑菌试验鉴定其生物活性.结果 MC多肽分子体外具有较强的抑菌活性,且抑菌活性持续时间长.结论 硫氧还蛋白在重组蛋白质中作为分子伴侣改变了天蚕素多肽分子生物活性,使其对宿主菌低毒性.MC多肽分子的体外长效抑菌能力使其具有良好的应用前景.
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家蝇抗菌肽基因Cecropin在COS-7细胞中的表达及产物活性初步研究
目的 初步研究家蝇抗菌肽Cecropin cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其产物的抗菌作用.方法 以Cecropin基因为模板设计2条特异引物,扩增在C端含6×His标签的Cecropin开放阅读框序列,将此序列与真核表达载体pcDNA3.1(+)进行重组,构建重组质粒pcDNA3.1(+)/Cecropin-His_6.以脂质体Lipofectamine TM 2 000为载体,对COS-7细胞进行重组质粒pcDNA3.1(+)/Cecropin-His_6和空载体pcDNA3.1(+)的转染,72 h后收集细胞培养上清液,表达产物经His-Trap HP亲合层析柱分离纯化和Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定后,进行杀菌活性的初步检测.结果 转染了重组质粒pcDNA3.1(+)/Cecropin-His_6细胞培养上清液的纯化物,行Tricine-SDS-PAGE电泳得到与预期分子量大小相符的单一目的条带,该纯化物对大肠杆菌E.coli K12D31具有一定的杀菌活性.结论 家蝇抗菌肽Cecropin cDNA在COS-7中得到了正确表达.
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天蚕素多肽分子对大肠埃希菌的抑制作用
目的 体外重组表达家蝇天蚕素成熟肽分子,观察其对临床分离的多重耐药大肠埃希菌(E.coli)体外抑制作用.方法 PCR克隆天蚕素成熟肽(Mature Cecropin,MC)基因,在MC基因前加入色氨酸密码子(TGG)连接于pET32a质粒的硫氧还蛋白基因后,构建重组质粒pET32a-MC.转化E.coli/BL21(DE3)中.IPTG诱导重组融合蛋白质Thioredoxin(硫氧还蛋白,Trx)-MC表达.融合蛋白质纯化后,经胃蛋白酶37 ℃水解.融合蛋白质中的天蚕素氨基酸序列具有抗胃蛋白酶能力不被水解,融合蛋白质其余部分被胃蛋白酶水解成小于2 kD的碎片,使用透析袋分离、纯化、浓缩,获得天蚕素成熟肽分子.水解产物经Tricine-SDS-PAGE验证,获得一条与天蚕素分子大小相近的条带.采用液态生长抑制试验检验天蚕素分子对E.coli抑制作用,观察其对标准菌株ATCC 25922及临床分离多重耐药菌株的抑制活性.结果 MC成熟肽分子体外对E.coli标准菌株的抑制活性较强,标准菌株较多重耐药菌株受抑制得更快,但两者均能被天蚕素分子抑制.结论 天蚕素多肽分子对E.coli多重耐药菌株具有抑制作用.
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家蝇幼虫抗菌肽天蚕素基因的克隆及其在大肠杆菌中融合表达
目的 从家蝇三龄幼虫中提取总RNA,先利用RT-PCR扩增编码天蚕素Cecropin的cDNA序列,克隆入T载体pUCm-T并测定其序列.然后以pUCm-T/Cecropin为模板,通过PCR方法扩增Cecropin成熟肽cDNA序列,并将该序列的N-端大肠杆菌稀有密码子GGA点突变为GGC,C-端终止密码子TAA前加进一个天冬酰胺(Asn)密码子AAC,命名为mCecropin.mCecropin基因序列克隆至融合表达载体pGEX-4T-1中.酶切分析和测序鉴定后,将阳性重组子质粒转入不同的大肠杆菌宿主细胞中进行融合表达.经SDS-PAGE分析,选用E. Coli BL21(DE3)作为表达宿主菌.表达的融合蛋白GSTmCecropin通过GSTrap亲合柱纯化后用凝血酶酶切GST标签,mCecropin经HiTrap柱进一步纯化后,具有较强的抗菌活性.
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应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统高效表达家蝇天蚕素
目的 应用伴侣分子在大肠杆菌表达系统中高效表达家蝇天蚕素,研究伴侣分子对家蝇天蚕素基因在大肠杆菌中表达的影响.方法 RT-PCR克隆家蝇的天蚕素成熟肽(mature cecropin,MC)与泛素(ubiquitin,UBI)基因,利用牛物信息学方法分析硫氧还蛋白(thioredoxin,Trx)-MC和MC分子结构及Trx-MC分子和Trx-UBI-MC两种融合蛋白mRNA 5'端的二级结构的异同.分别构建pET32a-MC和pET32a-UBI-MC两种重组质粒,转化入大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中.检测Trx-MC融合蛋白的表达和pET32a-MC和pET32a-UBI-MC在相同诱导时间及诱导剂浓度的条件下,融合蛋白表达量的差异.结果 生物信息学分析结果显示MC分子被Trx分子包裹在其内部,MC分子的细胞毒性被去除,使其可以在大肠杆菌中正常表达.分子生物学实验结果进一步验证了生物信息学分析结果的正确性.同时,也显示UBI分子的加入,未影响融合蛋白质Trx-UBI-MC与Trx-MC的mRNA5'端二级结构.并且Trx-UBI-MC融合蛋白在全菌蛋白中的含量明显高于Trx-MC.结论 Trx作为伴侣分子包裹了MC的天然结构.使其对宿主菌无毒性.UBI作为伴侣分子,在相同转录水平、翻译水平条件下,明显提高了蛋白的表达量.
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昆虫抗菌肽的研究进展
抗菌肽是一类新型的抗菌物质,从低等的生物病毒、细菌到高等的动植物都有广泛分布.抗菌肽具有普通抗生素所不具有的一系列优点,同时,抗菌肽及人工合成的抗菌肽基因在动植物中可以被表达并具有杀菌活性,有望开发成为新一代的抗菌药物.本文从昆虫抗菌肽的类型及结构特征、生物活性及杀菌机制、结构与活性的关系、基因结构和基因工程、研究展望与应用前景等几个方面对其研究进展进行综述.
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抗菌肽Cecropin-His-6基因的真核表达及其生物活性研究
目的研究家蝇幼虫Cecropin-His-6抗菌肽基因生物学功能. 方法从家蝇幼虫体内扩增Cecropin-His-6抗菌肽基因,构建pcDNA3.1/Cecropin-His-6重组表达质粒并用脂质体转染CHO细胞中,G418筛选,HisTrap HP亲和层析柱纯化目的蛋白,琼脂糖平板抑菌试验检测目的蛋白的抗菌活性. 结果pcDNA3.1/Cecropin-His-6重组质粒成功转染入CHO细胞中,并获得具有抗菌活性的Cecropin-His-6目的蛋白. 结论家蝇幼虫抗菌肽哺乳动物型工程细胞表达系统的建立,为进一步制备抗耐药菌的肽类抗生素奠定了基础.
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家蝇幼虫天蚕素基因的克隆与序列分析
目的对家蝇幼虫天蚕素基因进行克隆和序列分析.方法根据Genbank公布的家蝇成虫天蚕素Cecropin基因序列设计一对引物,以家蝇幼虫cDNA文库液为模板,PCR扩增该基因的编码区序列.结果家蝇幼虫天蚕素cDNA目的基因的长度为229bp,与成虫防御素基因一致性为96%;大的ORF位于20bp～211bp,含192bp,编码63个氨基酸.结论初步预测了该基因编码蛋白的化学性质和二级结构,为该基因的重组表达研究打下基础.
