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在石蜡切片上显示水解酶的方法探讨
恒冷箱冰冻切片,冰冻替代法及冰冻干燥切片能显示组织中的水解酶,且各具优点与特色,但均需一定的设备,一定的条件,在基层或现场检测有关酶活性尚有困难.为了使石蜡切片显示水解酶达到令人满意的结果,我们对不同的固定液、不同处理方法进行了探讨,旨在推荐一个能被广泛采用的简便、稳定的制片方法.
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人红细胞对糖类摄取的规律性研究
人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义.一些糖类,特别是海藻糖,能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性,但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战.本研究探讨人红细胞对糖类摄取的规律性.于不同温度(4、25和37℃)、不同浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L)及不同培育时间(1、3、5、7、9小时)条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量,并测定了红细胞变性指数.结果表明:随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加,红细胞的糖吸收率也随之上升,细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmnol/L和40 mmol/L以上.但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同,随着时间的延长,细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势,而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势.但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响,尤其是海藻糖,这主要来源于渗透压伤害.结论:红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切,而且在一定条件下的糖吸收效率也较高,但此过程对红细胞有一定的伤害,这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景.今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系.
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冰冻干燥红细胞超微结构的分析
本研究的目的是探讨冰冻干燥红细胞在电镜下的形态变化.全血采自健康献血者,实验分为3组. 组1: 新鲜红细胞,4℃保存不超过24小时; 组2: 红细胞中加入终浓度为35%的甘油,-80℃保存24小时; 组3: 红细胞经过预处理,冰冻干燥16小时.对解冻红细胞或水化重悬冰冻干燥的红细胞进行计数,电镜下观察3组红细胞超微结构,并对电镜下红细胞平均直径、平均光密度及积分光密度进行图像分析.平均光密度及积分光密度代表细胞内血红蛋白的相对含量.结果表明,冰冻干燥后红细胞回收率为53%,红细胞具有圆盘状的结构.组1红细胞平均直径(μm)、平均光密度及积分光密度分别为4.7±0.4, 0.14±0.02, 1.58±0.46; 组2红细胞平均直径(μm)、平均光密度及积分光密度分别为4.6±0.7, 0.14±0.02, 2.35±0.64; 组3红细胞平均直径(μm)、平均光密度及积分光密度分别为4.4±0.4, 0.17±0.05和2.35±0.46.对电镜下红细胞平均直径、平均光密度及积分光密度数据进行统计学处理,三元方差分析的 Wilks′ Lambda 检验显示,组3与组2之间无显著差异,组3与组1相比较差异显著.结论:冰冻干燥红细胞具有相对完整的超微结构,平均直径及血红蛋白的含量与冰冻保存红细胞相似.
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去除血型抗体制备O型红细胞的研究
目的 建立去除血浆中血型抗体的O型红细胞的制备工艺,为临床提供安全的O型红细胞制剂.方法 使用处理后的冰冻干燥A型、B型红细胞膜,分别加入O型红细胞血浆中吸附血浆血型抗体物质,并检测吸附后红细胞的结构和功能.结果 使用海藻糖冻干保存红细胞膜可保存其抗原性,吸附后,可去除血浆中抗A、抗B抗体80%-99%,同时红细胞变形指数、ATP、渗透脆性、上清游离Hb含量与吸附前(正常红细胞)比较差异无统计学意义(P＞0.05),均在正常参考范围;流式结果 显示,吸附后采用离心方法 ,红细胞膜去除率可达到77%.结论 用冰冻干燥红细胞膜去除ABO血型抗体为O型红细胞的他型输注奠定了基础.
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再水化液因素对冰冻干燥保存后红细胞回收率的影响
目的寻求一种能有效提高冰冻干燥(简称冻干)保存后人红细胞回收率的再水化体系.方法测定10%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、6%羟乙淀粉(HES)、5%羧甲基淀粉钠(CMS)、生理盐水、0.75mol/L葡萄糖、等渗缓冲液及高渗缓冲液(5×Buffer)的晶体渗透压和胶体渗透压;将浓缩红细胞和保护液混匀,预冻后移入冻干机内作冻干处理,冻干完毕后,用不同种类或不同温度的再水化液快速水化洗涤样本.结果人红细胞冻干再水化后,6%HFS组、10%PVP组和5%CMS组的红细胞回收率分别为(93.65±6.18)%、(88.80±9.49)%和(91.34±8.13)%,血红蛋白回收率分别为(93.48±4.67)%、(89.02±4.67)%和(88.79±5.35)%,均极显著高于其他4组[(15.56±12.02)%～(27.77±6.48)%.(17.78±10.80)%～(41.50±6.43)%)](P＜0.01);不同温度的6%HES的再水化效果表明,再水化后3个温度组的红细胞回收率无显著差异,但37℃和25℃组的血红蛋白回收率分别为(87.18士5.84)%和(91.37±3.94)%.均极显著高于4℃组(73.10±5.90)%(P＜0.01)而且上清游离血红蛋白浓度也显著低于4℃组.结论再水化液的胶体渗透压对冻干保存后红细胞的保护作用要强于晶体渗透压,所以在等渗缓冲液中添加大分子物质作为再水化液的效果较好;另外再水化液的温度较高(＞25℃)时的再水化效果要好干4℃时的效果.
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海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存中的效果比较
目的比较海藻糖和蔗糖在人红细胞冰冻干燥保存过程中对细胞的保护效果.方法将浓缩红细胞、含有不同浓度海藻糖或蔗糖的30%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)按照1∶3(V/V)的比例混合,-80℃冰箱中预冻1h,入冻干机内冻干处理后,用37℃等渗缓冲液快速水化洗涤样品,然后将其分为3个处理组:组1为30%PVP组(简称PVP组),组2、3为含有5%、10%和15%海藻糖或蔗糖的30%PVP组(简称海藻糖组或蔗糖组),测定各项指标.结果冻干红细胞再水化后,海藻糖组的细胞回收率[(18.86±4.63)%、(21.73±7.32)%和(18.01±4.53)%]显著低于PVP组[(45.97±11.77)%](P＜0.01);蔗糖组,蔗糖浓度为5%、10%时,细胞回收率分别为(37.40±2.90)%和(37.77±4.78)%,二者显著低于PVP组(P＜0.05),但当蔗糖浓度升至15%时,细胞回收率[(42.54±10.25)%]和PVP组无显著差异;血红蛋白回收率,海藻糖组[(50.00±3.47)%、(40.91±9.09)%和(52.09±7.01)%]显著低于PVP组[(77.27±3.63)%](P＜0.05),而蔗糖组和PVP组无显著差异,且显著高于海藻糖组(P＜0.05).洗涤后3组的游离血红蛋白浓度均＜1g/L,其余各项指标的对比关系类似于水化后指标.结论在冻干保护液中添加不同浓度的海藻糖或蔗糖对于提高冰冻干燥保存后红细胞的回收率和血红蛋白浓度作用不明显;但蔗糖可以提高冻干保存后红细胞的大变形指数且对红细胞冻干燥保存的效果要好于海藻糖.
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红细胞保存研究的新策略--冰冻干燥
成分血的输注在发达国家已占血液输注的90%以上,因此红细胞的保存研究倍受重视.血细胞的保存通常是在4℃条件下进行,保存时间可以有效地延续至42d.特殊情况下实行深低温保存,放在-80℃冰箱或液氮(-196℃)中长期保存[1].这两种方法都需要低温设备,在进一步改进保存技术的研究中,冰冻干燥红细胞已成为细胞保存研究的新策略,引起了人们的关注.现将以此为主要内容的研究作一简要文献回顾.
