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重组病毒rAAV2-MfE77.43转导小鼠对日本血吸虫攻击感染的抵抗作用
目的 探讨东方田鼠(Microtus fortis)骨髓E77.43基因片段(MfE77.43)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)攻击感染的抵抗作用. 方法 将MfE77.43构建至重组腺相关病毒(AAV2)载体上,磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞,纯化重组病毒rAAV2-MfE77.43后,提取转染后细胞总RNA,RT-PCR检测E77.43基因表达情况,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析rAAV2-MfE77.43纯度.将18只昆明小鼠随机分为3组,每组6只,实验组每鼠于第0、3、7天肌内注射生理盐水稀释5倍的rAAV2-MfE77.43病毒液400μl,阴性对照组和空白对照分别注射等量pAAV空载体和生理盐水.每次注射前取小鼠尾静脉血,斑点ELISA法检测小鼠血浆中E77.43表达情况.末次注射后,用日本血吸虫尾蚴经小鼠腹部贴片进行攻击感染,40条/鼠.感染后第41天,剖杀小鼠,分别收集各组小鼠的肝脏和小鼠体内的血吸虫成虫,计数成虫数和每克肝脏虫卵数(LEPG),计算减虫率和减卵率,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿病理特征. 结果 RT-PCR检测获得约330 bp的目的DNA片段.SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒rAAV2-MfE77.43外壳蛋白可见3条特征性蛋白条带,相对分子质量(尬)分别为87 000、72 000、62 000,且杂带较少,病毒纯度较好.斑点ELISA法检测结果显示,小鼠注射rAAV2-MfE77.43后第3天,血浆中E77.43蛋白开始表达,且稳定表达至第41天.实验组小鼠体内日本血吸虫成虫数和LEPG分别为20.16±3.93和19 800±2 715,均低于阴性对照组的29.16±2.44和28 000±2 192 (P＜0.01);实验组的减虫率和减卵率分别为27.3％和26.2％.HE染色可见,实验组小鼠肝脏虫卵周围嗜酸粒细胞和浸润炎性细胞较少,并以单个肉芽肿较为多见. 结论 东方田鼠E77.43基因对血吸虫感染具有一定的预防保护效果,提示E77.43基因可能参与东方田鼠天然抵抗日本血吸虫感染.
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东方田鼠血清组分对日本血吸虫童虫的体外杀伤力
目的探讨东方田鼠血清不同组分对日本血吸虫童虫的杀伤力,以期发现东方田鼠血清中参与其天然抗日本血吸虫的相关蛋白质.方法以离子交换柱层析及分子筛柱层析技术对东方田鼠血清蛋白质进行分离,将所得血清不同组分加入体外培养的2日龄日本血吸虫童虫中(100±20条/孔),计算童虫死亡率以判断血清不同组分对童虫的杀伤力.结果从东方田鼠血清分离出58个蛋白组分,其中6个组分具有明显的杀伤日本血吸虫童虫的活性,童虫死亡率均在37%以上,特别是组分18.1的童虫死亡率达87.5%,而阴性对照组童虫死亡率为25.0%(P＜0.01).结论东方田鼠血清中某些蛋白质参与其抗日本血吸虫的过程.
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东方田鼠天然抗体相关的日本血吸虫抗原基因筛选和克隆
目的研究东方田鼠对日本血吸虫感染天然抵抗力的蛋白分子基因.方法用未感染日本血吸虫的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆及测序.利用软件和互联网对核酸序列进行分析,确定目的基因.结果筛选出编码东方田鼠天然抵抗力相关的7种蛋白分子基因:三磷酸甘油醛脱氢酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、热休克蛋白、22.6 kDa膜相关抗原、副肌球蛋白、细胞色素C及组织蛋白酶B.结论东方田鼠对日本血吸虫的天然抵抗力可能有许多蛋白分子参与.
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东方田鼠IgG3抗体抗血吸虫病作用研究
采用ELISA方法,平行检测东方田鼠、BALB/c小鼠和昆明小鼠在攻击感染前、后的血清抗血吸虫童虫(SSA)、成虫(SAWA)和虫卵(SEA)IgG3抗体水平,并进行体内、外试验,观察IgG3抗体抗血吸虫效应.结果 攻击感染后第4周,东方田鼠抗SSA和SAWA的IgG3抗体水平增幅较大,分别较感染前增加79.6%和49.6%,BAUI/c小鼠IgG3抗体在攻击感染后无明显增加.野生和室内繁殖的东方田鼠的IgG3抗体所致童虫死亡率分别为昆明小鼠的5.88和2.35倍,前者还诱生出较高的减虫率(39.8%).提示东方田鼠IgG3抗体可能是其抗血吸虫感染的主要免疫物质.
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东方田鼠血清IgG抗体的快速纯化法
目的探索快速、高效纯化东方田鼠血清IgG抗体的方法.方法采用G蛋白或A蛋白亲和层析法,对3种东方田鼠血清IgG抗体进行纯化,比较抗体纯度和回收率.结果获得的IgG抗体纯度和回收率均以G蛋白亲和层析法为高.纯化的抗体活性高,与酶标二抗的吸附力分别为非IgG洗脱物的8.5倍和未纯化血清IgG的3.1倍.结论G蛋白亲和层析法纯化东方田鼠血清IgG快速、活性高,具有实用价值.
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东方田鼠肺成纤维细胞的分离培养及其对日本血吸虫的杀伤作用
目的 探索和建立东方田鼠肺成纤维细胞体外分离、培养的技术方法,并观察其对日本血吸虫的杀伤作用. 方法 运用含15％小牛血清的Dulbecco改良Eagle培养液(DMEM)和RPMI 1640两种培养体系,采用组织块贴壁法和胰酶消化法,分别对出生后1、3和5d的东方田鼠乳鼠肺成纤维细胞(Microtus fortis lung fibroblasts,MfLF)进行原代分离、培养,倒置显微镜下观察MfLF形态和生长特性.第2代和第3代MfLF培养上清与日本血吸虫童虫共培养96 h,观察其对童虫的杀伤效果. 结果 实验发现,采用胰酶消化法培养,只有少量MLF细胞缓慢贴壁生长,而组织块贴壁法MfLF贴壁速度较快.不同日龄幼鼠的肺成纤维细胞采用组织块贴壁法培养,细胞活率和细胞纯度以1～3日龄乳鼠为佳.在DMEM和RPMI 1640两种培养液中MfLF均可传代培养,两者无明显差异.MfLF体外只可传代4～5次.日本血吸虫童虫经第2代和第3代MfLF培养上清处理后,死亡率分别为9.5％和10.5％,与阴性对照(8.8％)比较差异无统计学意义(P＜0.05). 结论 提示组织块贴壁法适用于MfLF的体外培养,但MfLF培养上清对日本血吸虫童虫无明显杀伤效果.
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野生东方田鼠4种成纤维细胞培养上清对日本血吸虫童虫的体外杀伤效果
目的 为了明确野生东方田鼠4种成纤维细胞培养上清对体外培养的日本血吸虫童虫的杀伤效果.方法 以对数生长期的野生东方田鼠胚胎、皮肤、肺脏及腹腔成纤维细胞培养上清液(实验组)与血吸虫童虫共培养,以DMEM培养基为空白对照,以含体积分数20％的东方田鼠血清为阳性对照,96 h内观察与4种细胞培养上清共培养的童虫状态,统计死亡率.结果 与野生东方田鼠腹腔与肺脏成纤维细胞培养上清共培养72 h后,童虫出现死亡特征,表现为表膜皱缩,缢痕明显;96h后,虫体内容物模糊并溢出,与阳性对照组童虫死亡特征略有不同;野生东方田鼠皮肤、胚胎、腹腔和肺脏组织成纤维细胞培养上清共培养96 h的血吸虫童虫死亡率分别为8.30％±2.10％、9.30％±1.38％、17.20％±3.27％和15.10％±4.35％,与空白对照的童虫死亡率(7.70％±0.80％)相比表明,腹腔和肺脏成纤维细胞培养上清液对童虫具有明显杀伤效果(P＜0.05).结论 对数生长期的野生东方田鼠腹腔和肺脏成纤维细胞培养上清对日本血吸虫童虫的杀伤效果较明显.
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用LA-PCR方法克隆东方田鼠部分Y染色体序列
目的 克隆东方田鼠长江亚种(Microtus fortis calamorum)和宁夏指名亚种(Microtus fortis fortis)Y染色体的部分序列,并挖掘这两个亚种间的单核苷酸多态性位点(SNPs).方法 本研究利用依据Y染色体保守性靶标位点(YCATS)设计的引物,测得Y染色体上的8个内含子短片段序列,进而设计长片段PCR(LA-PCR)引物来获得相距几kb的两个内含子之间的长片段序列.结果 获得东方田鼠长江亚种和宁夏指名亚种Y染色体上的7300 bp序列,比对这两个亚种的序列后发现4个SNPs位点.结论 获得了田鼠Y染色体上的7 300 bp序列和4个SNPs位点.
关键词： 东方田鼠 单核苷酸多态性位点 Y染色体保守性靶标位点 长片段PCR -
四种群东方田鼠线粒体DNA D-loop多态性研究
目的 探讨我国不同地区东方田鼠线粒体DNA D-loop多态性.方法 对四个种群东方田鼠线粒体DNA(mt DNA)D-loop片段进行测序,并对测序结果用Clustal W软件进行比对,通过MEGA Version3.1软件构建基于平均遗传距离的NJ(neighbor-joining,邻接法)分子系统进化树,用Dnasp4.0分析所有序列的多态位点、核苷酸多样性、单倍型数目、单倍型多样性以及进行Tajima's中性显著性检验.结果 四个种群34个东方田鼠个体的mtDNA D-loop区全序列共发现19个单倍型,单倍型比例为55.88%,单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.934±0.024和0.04334±0.00285.以台湾田鼠(Microtus kikuchii)线粒体全序列(GenBank登录号AF348082)为对照,共检测到核苷酸变异位点172个,约占核苷酸总教的18.66%.由分子系统进化树可发现所有34只东方田鼠分为两大类,小体型黑龙江东方田鼠为一类,其他三个种群东方田鼠为另外一类,在这一类别中,又有两个分支,其中所有宁夏种群鼠及3只大体型黑龙江种群鼠为一个分支,所有洞庭湖种群鼠和其他5只大体型黑龙江种群鼠为另一个分支.结论 我国东方田鼠在mt DNA D-loop片段存在种内遗传多态性,种群内和种群间都存在一定的遗传变异,并且黑龙江小体型种群东方田鼠表现出与其他三种群东方田鼠更大的差异水平.
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东方田鼠人工繁育观察
目的 观察东方田鼠人工繁育状况,为抗日本血吸虫机制研究提供基础资料.方法 分别将东方田鼠长江中下游亚种(M.f.calamorum)洞庭湖种群、指名亚种(M.f.fortis)青铜峡种群、东北亚种(M.f.pelliceus)金山屯种群的野生鼠引入上海实验室人工繁育,饲料以专利配制之人工颗粒料喂养.观察统计其繁育特性.结果 三亚种的东方田鼠在上海实验室内饲育均能繁殖,可突破野外的季节性差异全年繁殖.妊娠期约20 d,平均窝产仔数洞庭湖种群为4.9±0.98只,青铜峡种群为5.3±1.06只,金山屯种群为3.97±0.52只.幼仔离乳率洞庭湖种群为89.7%±10.7%,青铜峡种群为97.2%±5.02%,金山屯种群为80.7%±9.09%.结论 三亚种东方田鼠人工繁育状况良好,为东方田鼠的实验动物化打下了基础.
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棘足甲胁虱成虫光镜和扫描电镜观察
为鉴别棘足甲胁虱提供较为详细的资料,运用光镜结合扫描电镜较详细地观察了采自宁夏青铜峡地区东方田鼠的该吸虱的形态.对口器、触角及附器、胸板形态和位置、胸部背板、足及爪的形状、侧背片的形状及主要的鉴别特征、腹部的背腹片、一些毛序及雌雄尾部生殖器进行了较为详细的描述,这些描述大多与其他学者的描述相一致.但作者没有观察到明显的腹片Ⅱ向两侧延伸与相应的侧背片相联等结构.
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东方田鼠种群的生物净化方法
目的 对普通级东方田鼠孕鼠实施剖宫取胎,获得一种东方田鼠种群的生物净化培育方法.方法 根据东方田鼠生殖特性,准确判断妊娠天数,实施剖宫取胎手术,用SPF级ICR小鼠和SD大鼠作为代乳母鼠带乳.结果 自2008年6月～2009年3月,总共对52只东方田鼠孕鼠实施剖宫取胎手术,成功实施手术35只,共获得东方田鼠幼仔186只,实际成活125只,成活率为67.2%.经检测无SPF等级大、小鼠要求排除的微生物和寄生虫.结论 东方田鼠生物净化获得成功,为其它特别是野生鼠类的生物净化提供可借鉴之处.
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野生和人工饲养洞庭湖种群东方田鼠血液及血清生化指标的测定
目的 比较野生和人工饲养洞庭湖种群东方田鼠血液及血清生化指标的差异.方法 采用SYSMEX iPOCH血常规测定仪和HITACHI 7020全自动生化分析仪对野生和人工饲养洞庭湖种群东方田鼠部分血液及血清生化指标进行测定和分析.结果 两类东方田鼠部分血液指标和血清中与脂肪代谢相关的部分生化指标有显著差异,部分指标无明显差异,并无明显的变化规律.结论 东方田鼠可作为潜在的脂肪肝动物模型.
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东方田鼠抗日本血吸虫病相关免疫学研究进展
东方田鼠是一种可以感染血吸虫但是感染后不致病的哺乳动物,体内可能存在对日本血吸虫先天的、可遗传的抗性机制.近年来随着东方田鼠实验动物化,人们对东方田鼠的这种抗性机制进行了深入研究.本文对近几年东方田鼠抗日本血吸虫病相关免疫学研究进展做一综述,从非特异性免疫和特异性免疫角度对东方田鼠这一特殊抗性进行总结及展望.
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2007年夏季引起轰动的东方田鼠
2007年6月,网站、电视、报刊等媒体纷纷发表消息,报道洞庭湖畔东方田鼠泛滥成灾,可能造成严重危害.有消息披露,当地东方田鼠多达20亿只;甚至提到,湖南省疾病预防控制系统已做好扑灭鼠疫的准备.一时间,东方田鼠大面积发生成为轰动全国的热点新闻,受到方方面面的关注.
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重组逆病毒pRevTRE-E77.43转导小鼠后抗血吸虫感染作用
目的 探讨东方田鼠E77.43基因片段治疗日本血吸虫感染的生物学功能.方法 构建pRevTRE-E77.43重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞,用Hygromycin筛选后获得稳定表达的细胞株,并进行重组逆转录病毒的包装、浓缩与纯化.通过静脉或腹腔途径将制备的重组病毒注射到日本血吸虫感染模型小鼠体内,探讨目的基因在小鼠体内的表达以及体内治疗血吸虫感染的作用.结果 病毒注射动物机体7 d后目的基因就有表达,且一直能持续表达45 d以上.pRevTRE-E77.43诱导小鼠产生了31.0％的减虫率,高于pRevTRE的1.2％(t=3.524,P<0.01);pRevTRE-E77.43诱导小鼠产生了35.0％的减卵率,高于pRevTRE的0.9％(t=9.485,P<0.01).结论 pRevTRE-E77.43能对血吸虫感染模型小鼠产生一定程度的治疗效果,说明东方田鼠E77.43基因参与了东方田鼠抗日本血吸虫感染的生物学作用过程.
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室内繁殖东方田鼠感染日本血吸虫的实验研究
目的 比较室内繁殖东方田鼠与昆明鼠感染日本血吸虫后不同阶段脏器病变以及体内日本血吸虫发育与存活状况.方法 采用日本血吸虫尾蚴感染健康东方田鼠和昆明鼠,在感染后12、20、40d剖杀,观察并比较东方田鼠以及昆明鼠肝、肾、肺等脏器组织病变及体内日本血吸虫发育与存活情况.结果 日本血吸虫感染后12、20 d昆明小鼠和感染40d后东方田鼠的内脏器官均未出现明显病变；感染12 d及20d后的东方田鼠肝脏、肾脏及脾脏出现明显白色结节,且以感染12d的组织病变更为明显,部分东方田鼠病变组织仅见于肝脏.病理切片显示,病变肝脏和肾脏组织中存在完整日本血吸虫虫体,与正常组织界限分明；而无病变的肝脏和肾脏组织病理切片未发现虫体.结论 室内繁殖东方田鼠感染日本血吸虫后12d免疫反应剧烈且存在明显的个体差异.
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东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析
目的 获得日本血吸虫病新的候选疫苗分子.方法 用对日本血吸虫具有天然抗性的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库,阳性克隆转入E. coli BM25.8环化成质粒,抽提质粒DNA,EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定,插入片段进行核苷酸序列测序,并进行生物信息学分析. 结果共获得12个不同的基因,插入片段长度为300～1 100 bp,其中2个具有完整的开放阅读框,为日本血吸虫新基因,命名为Sj-sMf1和Sj-sMf2,分别编码93个和61个氨基酸.前者含有cAMP磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点各1个,后者含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶C磷酸化位点. 结论用东方田鼠血清作为探针筛选到2个日本血吸虫新基因.
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东方田鼠血清蛋白组分体外杀伤日本血吸虫童虫作用的研究
目的 研究东方田鼠血清蛋白组分体外杀伤日本血吸虫童虫的作用.方法 采用逐级分离技术,包括硫酸铵盐析法、Sephacryl S-300分子筛层析法以及电泳洗脱法,将东方田鼠血清蛋白分离为球蛋白和白蛋白两大类,再按分子量大小依次将球蛋白分离为4个大的组分和12个小的组分,后有重点地进行细分.然后,将分离的蛋白组分与日本血吸虫童虫共同培育48 h,观察对童虫的杀伤效应. 结果东方田鼠球蛋白所致的童虫死亡率为59.2%,加补体后的死亡率为68.4%,明显高于BALB/c鼠球蛋白(分别为40.8%和45.2%);东方田鼠球蛋白中的2、3组蛋白的杀伤效果同其总球蛋白,其中的3.2、3.3、3.4组分杀伤效果分别达到45.1%、57.6%和67.2%.这3组蛋白的分子量主带为375、205 kDa和100～135 kDa,后者的杀伤效果接近于总球蛋白,补体有增强作用;BALB/c 鼠的4组球蛋白均无明显杀伤作用.这两种鼠的白蛋白对童虫的杀伤作用无明显差异.结论 东方田鼠球蛋白具有体外抗血吸虫童虫作用,其中的100～135 kDa组分可能为主要效应分子.
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东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因筛选
目的 寻找东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关靶基因.方法 利用东方田鼠血清以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库,将所得阳性克隆进行测序及生物信息学分析,确定目的基因.结果 经3轮筛选,特异性噬菌体得到有效富集(857倍),随机挑取58个克隆进行序列测定,获得了10条表达序列标签(EST)序列,其中7条与GenBank中登陆的日本血吸虫基因序列具有99%～100%同源性,1条与类人猿锌指蛋白基因有82%同源性.功能预测结果表明,大部分EST编码蛋白或多肽的功能主要是参与血吸虫基因表达调控.结论 发现了多个可能与东方田鼠抗血吸虫抗性相关的靶基因,为进一步阐述东方田鼠抗血吸虫病的分子机理奠定了基础.
关键词： 日本血吸虫 东方田鼠 噬菌体展示cDNA文库 靶基因 亲和淘洗
