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Nurr1基因与干细胞多巴胺能表型分化的研究进展
中枢神经移植治疗帕金森病未能得到广泛开展的主要原因是伦理道德问题和不能获取足量的供体组织等.因此,尝试基因工程化干细胞使之成为多巴胺能神经元以释放多巴胺递质来达到治疗的目的是目前研究的热点.核受体相关因子-1(nuclear receptor related factor 1,Nurr1)基因与多巴胺能表型的产生有密切关系,本文对Nurr1基因使干细胞向多巴胺能表型神经元样细胞分化的研究进展进行了综述,并提出了今后的研究方向.
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NURR1基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死
目的:比较C17.2神经干细胞和NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对脑梗死模型鼠神经功能缺损的改善效果,观察细胞移植后与宿主脑组织的整合、存活、移行及分化情况.方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.①实验材料:选取清洁级健康SD雄性大鼠78只,随机数字表法分为模型对照组、神经干细胞组、转基因神经干细胞组,26只/组.条件永生化神经干细胞系C17.2由哈佛大学儿童医院Even Synder教授惠赠.pAdeasy-NURR1重组复制缺陷性腺病毒由本实验室成功构建.Dil18荧光染料(Chemicon公司产品).②实验方法:收集C17.2神经干细胞和pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞,各分为两管,一管加入Dil18荧光示踪剂.各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,3 d后进行细胞移植,以江湾Ⅱ型脑立体定向仪进行立体定位,选择缺血半暗区3个位点为移植区:前囟头侧1 mm,旁开2 mm,深度1.2 mm;前囟尾侧3 mm,旁开1.5 mm,深度1.2 mm;前囟尾侧6 mm,旁开2 mm,深度1.2 mm.模型对照组每位点注射单纯培养液2 μL;神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的C17.2神经干细胞悬液2 μL,剩余20只每位点移植C17.2神经干细胞悬液2 μL;转基因神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2 μL,余20只每位点移植pAdeas-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2 μL.③实验评估:各组大鼠分别在移植前1 d及移植后1周、2周、1个月进行神经功能缺损评分.移植后1周、2周、1个月进行荧光示踪检查及神经元特异烯醇化酶免疫组化检测.移植后6个月行组织学检查.结果:移植后1周,模型对照组死亡1只,神经干细胞组死亡2组,转基因神经干细胞组死亡2只,均淘汰并予以补充.①神经功能缺损评分:移植前1 d各组大鼠神经功能缺损评分基本相似(P＞0.05).移植后1周、2周、1个月神经干细胞组、转基因神经干细胞组神经功能缺损评分均明显低于模型对照组(P＜0.05);转基因神经干细胞组下降趋势较神经干细胞组更为显著(P＜0.05).②Dil18荧光细胞示踪结果:移植后1周荧光示踪细胞主要在针道内,少数细胞开始移行至周围神经组织.移植后2周,细胞移行至更远距离,并明显向梗死灶方向移行,细胞有突触样结构与周围细胞形成联系.移植后1个月细胞向周围扩散,甚至在远隔部位也可见荧光细胞.③神经元特异烯醇化酶免疫组化检测结果:移植后2周、1个月,转基因神经干细胞组神经元特异烯醇化酶阳性细胞数均明显高于神经干细胞组(P均＜0.05).④细胞组织学检查:移植后6个月,各组大鼠注射针道周围脑组织仍呈正常的层次和结构,未见有明显异型细胞增生.结论:①NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗局灶性脑梗死能显著改善神经功能缺损,效果优于C17.2神经干细胞.②移植后供体细胞存活并向注射针道周围神经组织移行,促进神经干细胞向神经元方向的分化.
关键词： Nurr1基因 移植 脑梗死 C17.2神经干细胞 -
骨髓间充质干细胞、过表达Nurr1蛋白的骨髓间充质干细胞与胎脑细胞移植治疗帕金森病大鼠的比较
目的 探讨骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)和过表达Nurr1蛋白的MSC移植治疗帕金森病( Parkinson disease,PD)的效果.方法 携带Nurr1基因的真核表达质粒pcDNA3.1/Nurr1转染大鼠MSC,构建稳定高表达Nurr1蛋白的MSC克隆(Nurr1-MSC)；分别将Nurr1-MSC(Nurr1-MSC组)、MSC(MSC组)、胎鼠中脑腹侧细胞(VMC组)及生理盐水(对照组)植入PD大鼠纹状体,检测移植区Nurr1蛋白表达,观察移植前、后PD大鼠旋转行为变化,评估不同细胞移植治疗PD大鼠效果.结果 移植术后8周内,Nurr1-MSC持续高表达Nurr1蛋白,3种移植细胞均明显改善PD大鼠症状(P＜0.01),VMC组疗效佳且持久；Nurr1-MSC组4周内效果优于MSC组(P＜0.05),随时间延长其疗效逐渐减弱,至术后8周时与MSC组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MSC及Nurr1-MSC移植PD大鼠纹状体后均可改善PD症状,Nurr1-MSC治疗PD大鼠模型效果短期内优于MSC,长期效果与MSC接近,胎鼠中脑腹侧细胞治疗效果佳.
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AADC和NURR1基因联合c17.2神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究
目的研究芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因和NURR1基因联合c17.2神经干细胞脑内移植后对帕金森病模型大鼠的治疗效果.方法人类神经元性AADC基因和NURR1基因真核表达载体分别转染至c17.2神经干细胞内.将帕金森病(PD)模型大鼠随机分为4组,分别予以脑内毁损侧纹状区移植含空质粒的c17.2神经干细胞(A组),pCDNA3-AADC转染后的c17.2神经干细胞(B组),pCDNA3-NURR1转染后的c17.2神经干细胞(C组)以及含有pCDNA3-AADC和pCDNA3-NURR1转染后的c17.2神经干细胞(D组).观察其病理性旋转行为的改善,采用酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化方法研究脑内多巴胺含量的变化,并用荧光示踪方法观察C17.2细胞在PD模型脑内的移行.结果各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善(P＜0.05),尤以D组改善为明显,其行为学大改善达73.7%,且同A、B、C组间差异具有显著性(P＜0.05).免疫组化可见各组移植TH阳性细胞明显增多,TH染色的神经元树突或轴突密集,体内TH阳性区域明显较PD模型组扩大,其中尤以D组病理学改善为明显.荧光示踪观察c17.2神经干细胞有突触形成,并与临近的细胞建立突触联系.结论 AADC基因联合NURR1基因共转染c17.2神经干细胞脑内移植后改善了动物的旋转行为,增加了脑内多巴胺的表达,且植入的神经干细胞可同宿主神经元形成突触联接,为研究多基因联合神经干细胞移植治疗帕金森病提供了新方法.
关键词： 芳香族氨基酸脱羧酶基因 Nurr1基因 C17.2神经干细胞 帕金森病 基因治疗 -
Nurr1基因转染人脐血间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究
目的 探讨外源性Nurr1基因修饰的人脐血间充质干细胞在基因重组成纤维细胞生长因子-8(FGF8)和音猬因子(Shh)诱导下体外分化为多巴胺能神经元的情况.方法 间充质干细胞被随机分为A组(对照组)、B组(Nurr1组)、C组(FGF8+Shh组)及D组(Nurr1+FGF8+Shh),采用脂质体法将pcDNA3.1-Nurr1转染B、D组间充质干细胞,Western blot观察Nurr1基因表达情况,并在神经元条件培养液中进行增殖培养和诱导分化,间接免疫荧光染色法鉴定细胞性质,高效液相色谱法测定多巴胺含量.结果 Western blot结果显示转染后Nurr1蛋白表达明显增高.A组和B组末发现酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞,而C组和D组TH阳性细胞分别为10.12%±2.65%及25.36%±3.13%,多巴胺含量分别为(43.6±2.1)nmol/L及(83.2±3.5)nmol/L,差异均有显著性意(P＜0.01).结论 人脐血间充质干细胞在FGF8和Shh诱导下可以分化为多巴胺能神经元,外源性Nurr1基因修饰后,分化为多巴胺能神经元的数量增加.
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Nurr1基因修饰人脐血间充质干细胞源性多巴胺能神经元移植治疗帕金森病
[目的]探讨Nurr1基因修饰的人脐血间充质干细胞(HUCB-MSC)源性的多巴胺能神经元移植对帕金森病(PD)模型鼠的治疗作用.[方法]SD大鼠PD模型随机分为假手术组(A组)、单纯HUCB-MSC组(B组)、Nurr1基因修饰HUCB-MSC组(C组).将HUCB-MSC及Nurr1基因修饰后的HUCB-MSC体外分化为多巴胺能神经元,并通过立体定向的手段将其移植入毁损侧纹状体,观察移植前后PD模型大鼠旋转行为的变化和脑内多巴胺(DA)含量的改变,以及纹状体区酪氨酸羟化酶(TH)表达的变化.[结果]B、C两组在移植后第2周、4周和8周时旋转行为及脑内DA含量均较A组有所改善(P<0.05,P<0.01),且B、C组间比较C组改善明显(P<0.05),这种差异以第8周时为明显.移植后B、C两组TH表达较A组明显增高,并随着时间的增加而逐渐增高,且C组在各时间点上TH表达较B组含量高(P<0.05),并在移植后第8周时为明显.[结论]Nurr1基因修饰HUCB-MSC来源的多巴胺能神经元移植治疗PD模型鼠,能有效地增加鼠脑内多巴胺含量和纹状体区TH的表达,改善PD模型鼠的症状,为细胞移植治疗PD提供了一种崭新的手段.
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Nurr1基因与帕金森病
帕金森病(Parknson's disease,PD)是一种中老年人常见的神经系统变性疾病.目前该病的病因仍不清楚,现已经发现了与家族性PD相关的多个致病基因,但大多数PD患者为散发病例,其发病可能为环境因素与个体基因结构改变共同作用的结果.中脑多巴胺能神经元发育分化的基因调节机制的研究有助于理解PD多巴胺能细胞死亡的病因学和分子机制,近些年的研究显示孤儿核受体(Nurr1)是中脑多巴胺能神经元终分化和存活的重要转录因子[1].本文就Nurr1及其与PD发病相关的研究现状做一综述.[作者单位]四川大学华西医院神经内科,成都,610041
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NURR1基因多态性与帕金森病的关联研究
目的 了解NURR1基因多态性与四川地区散发性帕金森病之间的相关性.方法 采用病例-对照研究,应用聚合酶链反应、等位基因特异性、限制性片段长度多态性对四川地区汉族人群241例帕金森病患者和236名正常对照NURR1基冈启动子区的c.-2922(C)2-3及第6内含子的ⅣS6+18imG多态位点进行关联分析.结果 IVS6+18insG位点帕金森病组3G/3G,3G/2G,2G/2G基因型频率与对照组相比差异无统计学意义(X2=3.733,P=0.155).进一步按发病年龄分层后发现,50岁以前发病的帕金森病患者基因型频率与对照组之间差异有统计学意义(X2=6.545,P=0.038).发病年龄＜50岁的帕金森病组患者3G/2G基因型频率显著高于对照组(54.12%vs 38.14%),并且与其他两组基因型合并相比差异有统计学意义(X2=6.537,P=0.011;OR=1.913,95%CI:1.159～3.158).c.-2922(C)2-3位点帕金森病组与对照组相比3C/3C,3C/2C及2C/2C基因型频率差异无统计学意义(P=0.766).结论 本研究结果提示NURR1基因ⅣS6+18insG多态可能与本组人群早发性帕金森病的遗传易感性相关;未发现c.-2922(C)2-3位点多态性与本组人群帕金森病的遗传易感性相关.
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耐药性癫痫患者脑内Nurr1基因及蛋白产物的表达
目的 研究耐药性癫痫患者颞叶和海马组织中Nurr1基因及其蛋白产物的表达,探讨其在耐药性癫痫形成中的作用.方法 用RT-PCR和免疫组化联合检测40例耐药性癫痫患者(实验组)脑组织中Nurr1基因及蛋白产物的表达,并与11例对照组比较.结果 RT-PCR结果显示Nurr1 mRNA水平在耐药性癫痫患者脑组织中表达较对照组增高,Nurr1/GAPDH(内参基因)灰度值在耐药性癫痫患者脑组织中为6.18,对照组为2.39(P＜0.05).免疫组化与RT-PCR结果一致,显示耐药性癫痫颞叶和海马Nurr1蛋白表达水平高于对照组(P＜0.05).结论 Nurr1基因及其蛋白产物在耐药性癫痫患者脑内表达明显增加,提示其可能参与了耐药性癫痫的发生与发展.
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应用载体介导的RNA干扰技术抑制Nurr1基因在PT67细胞中的表达
本研究应用载体介导的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术特异地干扰孤儿核受体1(nuclear related factor1,Nurr1)基因的表达,以建立稳定的RNAi技术及用于下一步的Nurr1基因治疗研究.我们筛选了四对Nurr1基因的特异性序列 shRNA(short hairpin RNA),构建相应的载体(psilencerTM3.1-H1neo shRNA1, 2, 3, 4).分别将这4种质粒瞬时转染入已转染了逆转录病毒质粒pLNCX2-Nurr1并稳定表达Nurr1 基因的PT67细胞中.在转染后24、48和72 h分别采用免疫荧光、免疫组化、免疫印迹以及Real-time PCR的方法检测细胞中Nurrl蛋白及基因的表达水平.结果显示,转染psilencerTM3.1-H1neo shRNA 2、3号24 h和48 h后,经免疫荧光和免疫组化检测,Nurr1在PT67细胞中表达显著降低;免疫印迹结果也显示,Nurr1蛋白量明显低于阴性对照组.psilencerTM3.1-H1neo shRNA 1、4对Nurr1蛋白表达没有明显影响.Real-time PCR 相对定量结果也同样证实2、3号转染后Nurr1基因表达的干扰效果明显,而1、4号结果相对较弱.通过本实验,我们筛选出了两段Nurr1特异性siRNA序列,且干扰效果在转染后24 h至48 h时效果为明显.
