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谷胱甘肽S-转移酶-KGDX融合蛋白的抗血小板作用
目的观察重组GST-KGDX(谷胱甘肽S-转移酶-赖-甘-天冬-X)融合蛋白对血小板聚集的抑制作用.方法设计合成了两条编码KGDX(赖-甘-天冬-X)的寡核苷酸链,长度为36个碱基对,两端分别为BamHI酶和XcoI酶切位点.将该基因插入原核高效表达载体PGEX-4T-1的tac启动子下游,获得重组质粒PGEX-4T-1KGDX,转化大肠杆菌DH5a,37℃诱导使重组子表达.采用谷胱甘肽-琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯化蛋白.用血小板凝聚仪检测活性.结果 GST-KGDX融合蛋白具有可溶性,产量为35mg/升培养基,表达量占菌体总蛋白48.02%,容易从裂解菌中纯化得到.体外实验:GST、GST-KGDX融合蛋白均能抑制ADP诱导的人血小板聚集, GST-KGDX强于GST(p＜0.05或＜0.01),其IC50值分别为4μmol/L、6μmol/L.结论 (1)GST、GST-KGDX融合蛋白在体外均能抑制ADP诱导的人血小板聚集.(2)大肠杆菌中能够表达出较高产量的GST-KGDX融合蛋白,为抗血小板因子提供了一个很好的蛋白质来源.
关键词： 基因重组 表达及纯化 大肠杆菌 GPIIb/IIIa 拮抗剂 GST-KGDX融合蛋白 抗血小板作用 -
抗血小板多肽在大肠杆菌中的克隆和表达
设计合成了两条编码KGDX(赖-甘-天冬-X)的寡核苷酸链,长度为36个碱基对,两端分别为BamHI酶和XcoI酶切位点.将该基因插入原核高效表达载体PGEX-4T-1的tac启动子下游,获得重组质粒PGEX-4T-1KGDX,转化大肠杆菌DH5a,37℃诱导使重组子表达.GST-KGDX融合蛋白具有可溶性,产量为35mg/L培养基,表达量占菌体总蛋白48.02%.破碎菌体上清经谷胱甘肽-琼脂糖悬珠亲和层析法获得纯度为95%的重组蛋白.125I7E3竞争拮抗实验结果表明,GST无GPⅡb/Ⅲa结合作用,GST-KGD融合蛋白能代替7E3竞争性地与GPⅡb/Ⅲa受体特异性结合,从而抑制血小板聚集.其IC50值为40μmol/L.
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鲍曼不动杆菌外膜蛋白A的克隆表达及纯化
目的：通过分子克隆方法制备鲍曼不动杆菌外膜蛋白A（ OmpA）纯化蛋白，为进一步研究鲍曼不动杆菌OmpA蛋白的生物学活性提供基础。方法：首先采用PCR方法扩增鲍曼不动杆菌标准菌株 ATCC19606株外膜蛋白 A 编码基因（OmpA），构建其原核表达载体 pET30a／ompA，所得产物经PCR方法和测序进行鉴定。之后筛选阳性表达载体，将其转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21，后将表达的蛋白质进行纯化。结果：重组表达载体 pET30a／ompA 构建成功，并经 PCR方法和测序方法进行鉴定；重组蛋白在所构建的原核表达系统中实现了高表达，纯化后得到了高纯度的 OmpA 蛋白。结论：本次试验通过分子克隆技术，使鲍曼不动杆菌OmpA蛋白在构建的原核表达系统中成功表达，并且获得了高纯度的目标蛋白，为进一步研究鲍曼不动杆菌外膜蛋白A的生物学活性及抗体的保护作用奠定了基础。
