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杂合抗菌肽MLH在大肠埃希菌中的融合表达及其抑菌活性研究
目的 设计合成杂合肽MLH基因并在大肠埃希菌(Escherichia coli)表达系统中高效融合表达,获得具有抑菌活性的重组蛋白. 方法 以家蝇抗菌肽Md-Cec、人源抗菌肽LL-37和幽门螺杆菌肽Hp为母体肽,通过生物信息学分析筛选出一条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽MLH并根据E.coli密码子的偏好性编码基因.采用重叠延伸基因扩增(SOE-PCR)技术,通过设计合成3条互补引物合成所需的目的基因,与表达载体pET-3 2a(+)连接后转化至E.coli表达菌株BL21 (DE3),构建基因工程菌pET-32a-MLH/BL21(DE3),用含氨苄青霉素(Amp)的抗性平板筛选阳性菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后采用SDS-PAGE电泳和Western blot检测目的蛋白的表达.对发酵条件进行优化以获得融合蛋白的大量表达,采用Ni2+亲和层析柱纯化和透析复性的方法 将表达的融合蛋白进行纯化和复性,获取具有活性的融合蛋白,采用琼脂孔穴扩散法测定其抑菌活性. 结果 成功合成基因MLH并与表达载体连接形成重组质粒pET-32a-MLH,构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21(DE3),经IPTG诱导表达相对分子质量单位(Mr)约25×103的重组蛋白且主要以包涵体形式存在.对发酵条件进行优化,确定优发酵条件为:IPTG终浓度为1.0 mmol/L;诱导时间为4h;诱导温度为37℃.通过纯化以及复性处理得到重组蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用.结论 杂合抗菌肽MLH可在大肠埃希菌中融合表达且有一定抑菌活性.
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全长家蝇抗菌肽基因diptericin的克隆及生物信息学分析
目的 克隆新的家蝇抗菌肽基因双翅肽(diptericin)的全长序列并对其进行相关生物信息学分析.方法 根据本实验室已经克隆的家蝇抗菌肽基因diptericin片段设计1对引物,运用cDNA末端快速扩增技术(GeneRacer)、T-A克隆和序列测定,将所得序列与GenBank中已知的diptericin基因进行同源性分析.结果 成功地从免疫诱导的3龄幼虫中得到一个全长433 bp的基因cDNA,该全长cDNA具有完整的编码框,编码99个氨基酸,相关生物信息学分析结果表明,其与厩蜇蝇diptericinA基因的同源性高,为77%.结论 初步推断此全长cDNA是家蝇抗菌肽的一个新基因,可能广泛存在于蝇类昆虫中,为进一步研究其生物活性奠定基础.
关键词： 家蝇抗菌肽 diptericin基因 快速扩增技术 生物信息学分析 -
家蝇抗菌肽及其基因的克隆进展
家蝇抗菌肽是一类由结构基因编码的小分子肽类物质,是构成其自身防御体系的重要组分,具有广谱的抗菌、抗病毒、抑肿瘤细胞等生物活性,已引起人们的广泛关注.文中主要介绍家蝇抗菌肽的产生、结构特点、生物学功能及其基因的克隆进展.
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天然抗菌肽分离纯化方法的建立
目的 寻找高效、广谱的新型天然抗菌肽,建立稳定、有效的分离纯化方法.方法 家蝇免疫诱导后制成组织匀浆,经超速离心、分子筛过滤、Sephadex G50层析、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、透析浓缩等技术进行分离纯化,用K-B法鉴定抗菌活性.结果 组织提取液经超速离心后,用pH 6.8 Tris-HCl尿素缓冲液作流动相,Sephadex G50层析,收集到有明显抗菌活性的成分.再用pH 6.8磷酸盐缓冲液作流动相,经RP-HPLC半制备柱进一步纯化,各成分分离效果良好,保留时间为18.008 min处的谱峰,有明显的抗菌活性.用RP-HPLC分析柱显示其为单一成分,达到了色谱纯.该抗菌肽对大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)均有抗菌活性.结论 建立了有效的家蝇抗菌肽分离纯化方法,纯化的家蝇抗菌肽有广谱抗菌活性.
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家蝇幼虫抗菌肽diptericin_2基因的克隆及原核表达-鉴定
目的 扩增出全长diptericin2基因,并构建表达pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白.方法 运用经典的5'末端扩增法(5'-Full RACE)法,通过双酶切、连接反应,将目的基因片段定向插入到表达载体pGEX-4T-1上,转化大肠埃希菌BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析diptericin2重组蛋白的表达情况,蛋白质印迹实验(Western-blotting)对其进行了鉴定.结果 获得目的片段468bp的家蝇抗菌肽diptericin2基因(GENBANK登录号FJ795370),双酶切鉴定及DNA测序结果显示,目的基因diptericin2已成功连接到表达载体pGEX-4T-1上,SDS-PAGE结果显示表达产物相对分子质量约为27 kDa.结论 扩增出了全长diptericin2基因并成功构建pGEX-4T-1/diptericin2重组蛋白原核表达系统,融合蛋白以包涵体形式在大肠埃希菌BL21中表达,为下一步研究其生物活性打下初步的基础.
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家蝇抗菌肽分子结构及抗菌谱研究
目的 研究家蝇抗菌肽的分子结构和抗菌谱,寻找广谱高效天然抗菌肽.方法 家蝇被损伤感染诱导免疫后制成组织匀浆,用蛋白质纯化技术分离纯化抗菌肽,测定抗菌活性及抗菌谱,纳升电喷雾飞行时间质谱测定氨基酸序列.结果 家蝇组织提取液经蛋白质纯化,得到一纯化的抗菌活性成份,纳升电喷雾飞行时间质谱测序,得到两个肽段的氨基酸序列:肽段1.QPNLYYNK和肽段2.PNNVYYTK.通过NCBInr蛋白质数据库检索,未发现有与之序列相匹配的蛋白质.该抗菌肽对11种临床标本分离菌株铜绿色假单胞菌、大肠埃希菌、伤寒沙门菌、普通变形菌、异形柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、福氏痢疾杆菌、表葡菌、耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和白念珠菌的MIC分别为:3.89、2.22、4.44、6.67、3.33、6.67、5.0、6.67、4.44、4.44和13.33 μmol/L.结论 本文得到的抗菌肽是一个新型抗菌肽,有广谱抗菌活性,对革兰阴性菌和革兰阳性菌均有一定的抑制作用.
