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杂合抗菌肽MLH在大肠埃希菌中的融合表达及其抑菌活性研究
目的 设计合成杂合肽MLH基因并在大肠埃希菌(Escherichia coli)表达系统中高效融合表达,获得具有抑菌活性的重组蛋白. 方法 以家蝇抗菌肽Md-Cec、人源抗菌肽LL-37和幽门螺杆菌肽Hp为母体肽,通过生物信息学分析筛选出一条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽MLH并根据E.coli密码子的偏好性编码基因.采用重叠延伸基因扩增(SOE-PCR)技术,通过设计合成3条互补引物合成所需的目的基因,与表达载体pET-3 2a(+)连接后转化至E.coli表达菌株BL21 (DE3),构建基因工程菌pET-32a-MLH/BL21(DE3),用含氨苄青霉素(Amp)的抗性平板筛选阳性菌株,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后采用SDS-PAGE电泳和Western blot检测目的蛋白的表达.对发酵条件进行优化以获得融合蛋白的大量表达,采用Ni2+亲和层析柱纯化和透析复性的方法 将表达的融合蛋白进行纯化和复性,获取具有活性的融合蛋白,采用琼脂孔穴扩散法测定其抑菌活性. 结果 成功合成基因MLH并与表达载体连接形成重组质粒pET-32a-MLH,构建重组基因工程菌株pET-32a-MLH/BL21(DE3),经IPTG诱导表达相对分子质量单位(Mr)约25×103的重组蛋白且主要以包涵体形式存在.对发酵条件进行优化,确定优发酵条件为:IPTG终浓度为1.0 mmol/L;诱导时间为4h;诱导温度为37℃.通过纯化以及复性处理得到重组蛋白对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑制作用.结论 杂合抗菌肽MLH可在大肠埃希菌中融合表达且有一定抑菌活性.
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杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4在毕赤酵母中的分泌表达及活性鉴定
目的 在毕赤酵母中分泌表达具有抗菌活性的杂合抗菌肽Cecropin P1-Dermaseptin S4(CP1-DS4). 方法 根据毕赤酵母密码子的偏爱性优化Cecropin P1和Dermaseptin S4两抗菌肽基因序列,通过SOE-PCR拼接,构建克隆载体pMD18T-cp1-ds4并测序;pMD18T-cp1-ds4经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后构建重组表达载体pPICZαA-cp1-ds4,测序验证开放阅读框(ORF)正确后经SacⅠ线性化处理,然后电转化毕赤酵母X-33(800V,1mm电转化杯,15s电击1次)并利用Zeocin筛选阳性重组子.重组子接种BMGY、BMMY培养基,采用5％的甲醇诱导表达,采用Tricine-SDS-PAGE分析表达上清,表达上清浓缩后进行抑菌试验. 结果 在本研究中拼接引物经SOE PCR拼接后得到优化的长度为120bp的Dermaseptin S4基因基因片段,该片段与Cecropin P1基因连接形成约197bp杂合抗菌肽片段,成功构建pPICZdA-cp1-ds4表达载体,电转化获得重组酵母菌pPICZαA-cp1-ds4/X-33,经诱导后可产生分子质量单位约为9.7 ku的目的多肽,该多肽对大肠埃希菌和金黄葡萄球菌均有抑制作用. 结论 杂合肽CP1-DS4可以在毕赤酵母X-33中融合分泌表达,且具有抗菌活性.
