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编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性
目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性. 方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1.用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定.将100 μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性. 结果 DNA序列测定结果表明,将573 bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组. 结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性.
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弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅲ. pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫小鼠的保护性观察
目的观察重组质粒pcDNA3-HBsAg-GRA1 DNA 接种诱导的保护性免疫应答.方法质粒DNA免疫BALB/c小鼠;ELISA法检测GRA1、HBsAg抗体及亚类水平;提取各免疫组小鼠肌肉组织DNA 进行PCR检测;弓形虫RH强毒株攻击感染各免疫组小鼠.结果经pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫组小鼠产生抗GRA1和HBsAg抗体,且抗GRA1的抗体水平明显高于GRA1单独和GRA1与 HBsAg混合免疫组.弓形虫RH强毒株攻击感染pcDNA3-HBsAg-GRA1免疫组小鼠,其存活时间明显长于其他各组,结果提示HBsAg可能起免疫佐剂作用.结论将GRA1与HBsAg 融合明显增强了GRA1的免疫原性和保护性.
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弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究Ⅰ.pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒的构建及鉴定
目的构建pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索,并期望"一/+-苗两用".方法采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclⅠ、EcoRⅠ双酶切HBsAg;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体pcDNA3.0;HBsAg、GRA1、pcDNA3.0双酶切纯化产物与T4DNA连接酶在22℃连接过夜,用双酶切及双脱氧末端终止法测序鉴定重组质粒.结果成功构建pcDNA3-HBsAg-GRA1真核表达质粒.结论为进一步研究pcDNA3-HBsAg-GRA1诱导的保护性免疫奠定了基础.
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弓形虫真核表达质粒pcDNA3/ GRA1的构建及序列测定
目的:构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础.方法:采用PCR扩增出编码GRA1目的基因,用EcoRⅠ/XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切,将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点;对重组质粒进行PCR,双酶切初步鉴定后做序列测定.结果:特异扩增出预计的GRA1片段,大小为573 bp;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中,经PCR,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框.结论:成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒.
