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北京市西城区手足口病柯萨奇病毒A5型VP4区基因特征分析
目的 分析2009年北京市西城区手足口病柯萨奇病毒A5型(CoxA5)的VP4区基因特征,了解其变异情况.方法 采集手足口病患儿咽试子,提取病毒RNA,用肠道病毒VP4区分型引物进行半巢式RT-PCR(RT-nPCR),通过测序和GenBank Blast比对确定肠道病毒型别,并对其VP4区进行序列和进化分析. 结果 共鉴定出5株CoxA5,GenBank登录号为JN981017- JN981021.在VP4区,5株CoxA5与中国株HQ728261核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96％～99％和98％～100％.进化分析表明,5株CoxA5与中国株HQ728261遗传距离为0.005～0.045,共同构成一个独立的进化树分支.5株CoxA5在VP4区无氨基酸的缺失和插入,未发现特有的氨基酸置换. 结论 2009年北京市西城区手足口病病原体CoxA5VP4区与中国株HQ728261在进化上密切相关,其序列未发生明显变异.
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手足口病柯萨奇病毒A2、A4和A5型SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立
目的 建立一种快速、灵敏、特异的SYBR GreenⅠ实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法,以期用于检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型. 方法 根据3种病毒vp1基因保守序列设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠ rRT-PCR方法.分别构建3种病毒的vp1部分基因的重组质粒作为病毒的体外转录标准品,分别以100～109和102～105倍稀释的标准品、其他6种肠道病毒、两种呼吸道RNA病毒及以临床诊断为手足口病的临床标本为模板,经过优化SYBR Green Ⅰ rRT-PCR反应条件,建立标准曲线和溶解曲线对其灵敏度、重复性、特异性进行评价,分析其临床应用中的效果. 结果 成功建立了3种柯萨奇病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量rRT-PCR方法及定量标准曲线,方法的灵敏度为101copies/μ1质粒标准品,变异系数均＜2％,与柯萨奇病毒A组6、10、16型,肠道病毒EV71型,诺如病毒,轮状病毒,麻疹病毒和乙型流感病毒均无交叉反应.检测84份手足口病临床标本,阳性率分别为36.9％ (CVA4)、8.33％ (CVA5)和7.14％ (CVA2),经测序验证符合率为100％. 结论 建立的检测柯萨奇病毒A2、A4和A5型的SYBR GreenⅠ rRT-PCR方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可用于手足口病病原体的分型检测.
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双重荧光定量RT-PCR法检测柯萨奇病毒A2和A5型
目的 建立同时检测柯萨奇病毒A2和A5型(CVA2、CVA5)的双重实时荧光定量RT-PCR法.方法 用Primer Express 3.0软件设计高度特异性引物和荧光标记探针.通过优化反应体系,建立标准曲线,并评价双重荧光定量RT-PCR法的特异性、灵敏度和重复性.用建立的方法检测367例疑似手足口病患儿的粪便标本,并对阳性结果测序验证.结果 荧光定量RT-PCR结果表明本实验所选的引物和探针可特异性检测并区分出CVA2、CVA5亚型,与其他肠道病毒的阳性核酸未发生交叉反应.该方法低检测限达到102 copies/mL,批内变异系数(CV)均＜1.49％.367份临床标本中CVA2型阳性23份,阳性率6.3％;CVA5阳性11份,阳性率3％,检测阳性结果与测序结果一致.结论 成功建立了在单管中同时检测并鉴别CVA2、CVA5型的双重实时荧光定量RT-PCR检测方法.该方法具有较好的灵敏度、特异性、重复性,可用于CVA2、CVA5型引起的暴发疫情的快速筛查和手足口病的流行病学的研究.
