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乙型肝炎病毒正链负性调节元件的亚元件鉴定
目的 研究乙型肝炎病毒正链负性调节元件(HBVnt453～250)中存在的重要功能亚元件. 方法 通过构建pHBVnt453～250质粒一系列缺失10 bp的突变体,与内参Prl-TK质粒共转染HepG2细胞,于转染后48 h检测荧光素酶活性并确定亚元件的位置和序列.构建亚元件与Pgl3-control载体质粒的重组质粒,与内参Prl-TK质粒共转染HepG2细胞并检测荧光素酶活性,半定量RT-PCR检测荧光素酶的Mrna水平. 结果 与pHBVnt453～250对照组比较,6个缺失突变体实验组的荧光素酶活性恢复到60%～80%,鉴定出3个功能亚元件.这3个亚元件的重组质粒荧光素酶活性比Pgl3-control对照组降低,半定量RT-PCR显示荧光素酶的Mrna水平降低. 结论 HBVnt453～250序列中含有3个重要功能亚元件,以协同的方式发挥调节抑制作用.
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HBVnt453-250负性调节元件作用方式与嗜肝性的研究
目的 HBVnt453-250序列为乙型肝炎病毒正链的一个新的负性调节元件,探讨其作用方式是否具有方向位点依赖性、启动子选择性以及肝细胞特异性.方法 构建含有负性调节元件的质粒pHBV453-250方向和位点置换体(pHBV250-453、plucHBV453-250和plucHBV250-453),分别以荧光素酶(luciferase)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因,转染HepG2细胞后,通过双荧光素酶体系、荧光定量PCR和Western blot分析,检测HBVnt453-250序列对目的基因转录及表达的影响;构建启动子置换的质粒pCMV453-250(luc),转染HepG2细胞后,双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达;将pHBV453-250和pHBV250-453分别转染人宫颈癌细胞(HeLa)和人肺癌细胞(A549),双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达.结果 HBVnt453-250序列以正向或反向插入荧光素酶或EGFP基因的5'端或3'端时,均能表现对目的基因转录和表达的下调作用;在CMV启动子引导下,HBVnt453-250序列明显降低了荧光素酶的活性,为对照的36.56%;正反向的HBVnt453-250序列均能在两种非肝源性细胞系中抑制荧光素酶活性.结论 HBVnt453-250序列的负性调节作用无方向及位点特异性,无启动子选择性及肝细胞特异性.
