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境外输入性恶性疟原虫药物抗性基因多态性分析
目的 了解河南省输入性恶性疟原虫相关抗性基因的突变情况. 方法 采集河南省2016年自非洲劳务返乡的131例输入性恶性疟患者血样,提取DNA,采用Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因序列引物进行巢式PCR扩增并测序,对测序结果进行序列比对,分析基因突变情况. 结果 131例输入性恶性疟患者自19个非洲国家务工返乡.131份血样均扩增出Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因片段.其中Pfdhfr基因51,59和108位点氨基酸双突变NRNI型占2.29％,IC-NI型占10.69％,三突变IRNI型占85.49％,野生型占1.53％,未见四突变.Pfmdr1基因86突变率分别为9.16％,K13突变率为11.45％,共15份血样检测到9个位点突变. 结论 2016年河南省输入性恶性疟原虫Pfdhfr、Pfmdr1和K13基因均有不同程度的突变,其中Pfdhfr基因三突变型所占比例较高,K13基因未检测到与青蒿素抗性相关的突变.
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河南省输入性恶性疟原虫多药抗性基因1和K13基因的突变分析
目的 对河南省2013-2015年输入性恶性疟原虫多药抗性基因1(Pfmdr1)和K13基因进行检测,分析其基因突变情况.方法 采集河南省2013-2015年自非洲返乡的被确诊为输入性恶性疟患者的血样,并收集病例的相关信息.提取患者血样中疟原虫基因组DNA,巢式PCR扩增Pfmdr1和K13基因,对扩增序列进行测序、比对,分析基因的突变情况.结果 386例输入性恶性疟患者以男性青壮年为主,自26个非洲国家返乡,其中病例数居前3位的输入来源国为安哥拉、赤道几内亚和尼日利亚,其病例数分别占总病例数的22.5％ (87/386)、13.7％ (53/386)和13.2％ (51/386).386份血样均成功扩增出Pfmdr1和K13基因.测序结果显示,Pfmdr1的86和1246位点的突变率分别为23.6％ (91/386)和3.1％ (12/386),K13基因的突变率为5.4％ (21/386).21份K13基因突变的血样来自于安哥拉、赤道几内亚和尼日利亚等10个国家,未发现C580Y突变.在来自安哥拉和赤道几内亚的血样中检测到2个与青蒿素抗性相关的突变,分别为R539T和P574L,突变率均为0.3％ (1/386).2013-2015年,Pfmdr1的86位点的突变率分别为28.8％ (36/125)、23.4％ (32/137)和18.6％(23/124),各年份突变率的差异有统计学意义(x2=6.438,P＜0.05);1246位点突变率分别为4.0％(5/125)、3.7％ (5/137)和1.6％(2/124),各年份突变率的差异无统计学意义(x2=1.384,P＞0.05);K13基因的突变率分别为3.2％ (4/125)、8.8％ (12/137)和4.0％ (5/124),各年份突变率的差异无统计学意义(x2=4.631,P＞0.05).结论 Pfmdr1的86和1246位点的突变率分别为23.6％ (91/386)和3.1％ (12/386),K13基因的突变率为5.4％ (21/386),发现了与青蒿素抗性相关的R539T和P574L位点突变.
关键词： 输入性疟疾 恶性疟原虫 恶性疟原虫多药抗性基因1 K13基因 突变 -
中缅边境及泰国东南地区恶性疟原虫K13基因侧翼微卫星多态性研究
目的 研究中缅边境拉咱地区和泰国东南Srisaket、Trat和Ranong等3个地区恶性疟原虫(Plas modium falciparum)K13基因侧翼微卫星的多态性.方法 取前期经基因型研究的恶性疟原虫样品42份,其中中缅边境拉咱地区22份(K13基因R539T突变型和野生型各11份),泰国3个地区20份(K13基因R539T突变型9份和野生型11份),对上述样品K13基因上游31900、6360、150 bp和下游1700、11000、31500 bp共6个位点的微卫星片段进行PCR扩增,PCR产物经毛细管电泳仪检测片段长度,并采用Bio Calculator软件进行数据分析,GenALEx软件计算等位基因频率和期望杂合度(He).结果 中缅边境拉咱地区和泰国3个地区恶性疟原虫虫株K13基因两侧的6个微卫星位点共检测到46个等位基因,在上游6360 bp位点的等位基因长度分别集中在286和278 bp,等位基因频率为73％和67％.上游31900 bp位点等位基因长度分别集中在211和205 bp,等位基因频率为55％和44％.上游150 bp及下游1700 bp位点等位基因长度主要集中在195和209 bp,其他两个位点未出现集中分布的情况.中缅边境拉咱地区虫株的单倍体型为H1至H4型,泰国3个地区虫株除了2株H2单体型外,其余均为H5和H6型.42份样品的6个微卫星位点的平均He分别为0.49±0.23、0.42±0.33和0.72±0.12、0.67±0.11.R539T突变的虫株在毗邻K13基因的微卫星位点处He明显降低,在上游150 bp处分别为0.17和0,在下游1700 bp处分别为0.3和0.结论 中缅边境拉咱地区及泰国3个地区K13基因为R539T突变型的恶性疟原虫虫株均受到青蒿素选择压力,等位基因型在上游6360和31900bp两个位点上具有明显的差异.
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恶性疟原虫青蒿素抗性相关k13基因及其C-末端功能域的克隆及表达
目的 探索在大肠埃希菌中表达恶性疟原虫青蒿素抗性相关基因k13及其C-末端propeHer结构域,为后续蛋白结构分析及青蒿素抗性机制等功能研究奠定基础.方法 以恶性疟原虫基因组DNA为模板、PCR扩增k13及其C-末端基因片段并分别克隆至pET-28a载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)和Western blot检测重组蛋白的表达.再分别用恶性疟和间日疟患者血清进行重组蛋白rK13和rK 13-propeller的Western blot检测.结果 PCR扩增得到全长k13基因和k13-propeller片段,并构建了重组质粒pET-28a-k13和pET-28a-k13-propeller.SDS-PAGE电泳和Western blot检测表明,两重组蛋白均表达,且重组蛋白rK13可与恶性疟患者血清反应,rK 13-propeller既可与恶性疟又可与间日疟患者血清反应.结论 利用原核表达系统成功表达重组蛋白rK13和rK13-propeller,两重组蛋白能够与疟疾患者血清反应,且与不同种疟疾的患者血清反应的特异性有所不同.
关键词： 恶性疟原虫 K13基因 k13-螺旋桨样基因片段 重组蛋白 原核表达
