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铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达
目的 构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达.方法 以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法 扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1入T,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western b1ot对表达产物进行分析和鉴定.结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果 一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别.结论 成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coli BL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性.
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铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定
目的 构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb)-OprF疫苗.方法 以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT-PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF.转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段.结论 成功构建了铜绿假单胞菌rBb-OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OprH基因扩增、融合、克隆及原核表达
目的在大肠杆菌中串联表达铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF和OPrH,获得重组融合蛋白OprF/H,为抗铜绿假单胞菌的疫苗研究打下基础.方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,设计PCR引物扩增出OprF和OprH基因,扩增片段经过酶切、连接和PCR扩增后,割胶回收PCR产物并将其克隆至克隆质粒,测序后构建表达质粒pGEX-F/H,并转化大肠杆菌BL2l.结果重组表达质粒经IPTG诱导后表达融合外膜蛋白OprF/H.结论成功构建融合外膜蛋白OprF/H的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达成功.
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铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因的克隆与原核表达
[目的]克隆铜绿假单胞菌OprF基因,并进行原核表达,以期进一步开展铜绿假单胞菌基因工程疫苗的研究. [方法]利用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增出OprF基因.采用T-A克隆构建pMD18-T-OprF重组质粒,测序正确后经BamH Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切获得OprF片段,插入到表达载体pET32a,获得pET32a-OprF重组表达质粒并在表达宿主菌E.Coli BL21中诱导表达,利用Ni-NTA柱对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹进行鉴定. [结果]克隆OprF基因(459 bp)并经DNA测序证实,表达重组蛋白OprF并获得纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹鉴定正确.[结论]成功克隆了OprF基因并获得原核表达物,为铜绿假单胞菌的致病性研究和开展基因工程疫苗的研制奠定了基础.
