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hp0169基因在幽门螺杆菌感染GES-1细胞中的作用研究
目的 构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)hp0169基因的敲除突变株,研究其在Hp感染GES-1细胞中的作用. 方法 敲除质粒pSJHK为模板,通过同源重组双交换的方法构建hp0169基因敲除突变株(△0169),分析其与野生26695株的生长曲线及琼脂表面菌落扩散情况;通过FITC标记法检测两菌株对GES-1细胞的吸附率;以感染复数(MOI=200)构建Hp感染GES-1细胞体系,比较△0169突变株与野生株感染后致细胞凋亡及细胞活性变化的差异. 结果 通过质粒敲除、电击转化成功获得hp0169基因敲除突变株△0169.该突变株与野生菌株的生长曲线、琼脂表面菌落扩散情况基本一致,对GES-1细胞的吸附率差异无统计学意义(t值为1.102,P＞0.05).△0169突变株与野生株感染GES-1细胞活力分别为6 h(0.74±9.56)％、(0.90±6.31)％,12 h(0.53±7.89)％、(0.73±8.31)％,差异均有统计学意义(t值分别为-3.474,-2.880,P＜0.05);野生组和突变组GES-1细胞凋亡率分别为6 h(19.2±11.03)％、(20.4±8.67)％和12 h(29.3±14.47)％、(28.6±10.32)％,差异均无统计学意义(t值分别为-0.995,0.218,P＞0.05). 结论 Hp hp0169基因敲除后不影响其生长、运动以及对GES-1细胞的吸附,不影响细菌感染GES-1细胞致细胞凋亡的程度,但影响细菌感染致细胞活力下降的程度.这对研究Hp感染及致病机制有重要意义.
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幽门螺杆菌胶原蛋白酶HpPrtC的表达、纯化及结晶尝试
目的 原核表达、纯化并筛选幽门螺旋菌胶原蛋白酶的结晶条件.方法通过基因重组构建幽门螺杆菌hp0169基因重组表达质粒, 在大肠埃希菌进行重组蛋白的原核表达;经Ni 2+亲和层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析纯化蛋白;通过Hampton Research结晶试剂盒筛选蛋白结晶条件.结果 扩增的幽门螺杆菌hp0169基因片段略大于1 000bp, 构建重组质粒pET-28a-hp0169, 转化至大肠埃希菌BL21 (DE3) 菌株后以IPTG诱导表达该U32家族蛋白酶HpPrtC;亲和层析, 离子交换及凝胶过滤层析纯化的目标蛋白经SDS-PAGE鉴定为HpPrtC蛋白单体和二体, 分子质量单位 (Mr) 为50×103和100×103, 但以单体形式为主.使用结晶机器人筛选HpPrtC蛋白的初始结晶条件为0.2mol/L MgCl2, 0.1mol/L Tris, pH 8.5, 3.4mol/L己二醇.结论 HpPrtC可在大肠埃希菌中可溶性表达, 并具有较好的可结晶性, 为其结构与功能研究奠定了基础.
